人膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Notch1對NF-κB信號的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：
　　1．檢測Notch1胞內(nèi)段（NICD1）對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞NF-κB信號活性的影響
　　2．比較NICD1與其衍生肽段ΔNICD1（1773-2230）對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞NF-κB信號活性影響的差異性
　　3．檢測NICD1與其衍生肽段ΔNICD1（1773-2230）對NF-κBp65和NF-κB p50表達(dá)水平的影響
　　4．明確NICD1及其衍生肽段ΔNICD1（1773-2230）與N

2、F-κBp50之間的相互作用關(guān)系
　　方法：
　　1．以 pNL-IRES2-EGFP-NICD1為模板，通過 PCR法擴(kuò)增獲取目的基因NICD1和ΔNICD1（1773-2230）序列，再以p3xFlag-CMV-10為目標(biāo)載體，構(gòu)建標(biāo)簽融合的真核表達(dá)載體p3xFlag-CMV-10-NICD1和p3xFlag-CMV-10-ΔNICD1。
　　2．以p3xFlag-CMV-10-NICD1和p3xFlag-CMV-

3、10-ΔNICD1分別轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，并以Western Blot法鑒定NICD1和ΔNICD1在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　3．提取NICD1和ΔNICD1過表達(dá)的U251細(xì)胞的核蛋白，采用電泳遷移率分析實驗（EMSA）檢測NICD1和ΔNICD1過表達(dá)的U251細(xì)胞NF-κB的靶DNA結(jié)合活性。
　　4．分別提取NICD1和ΔNICD1過表達(dá)的U251細(xì)胞的總蛋白或核蛋白，采用Western Blot法檢測胞內(nèi)

4、以及核內(nèi)NF-κB p65和NF-κB p50的表達(dá)水平。
　　5．對NICD1和ΔNICD1過表達(dá)的U251細(xì)胞，行NICD1、ΔNICD1、p65、p50免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察p65和p50在胞內(nèi)的分布以及NICD1和ΔNICD1與p50在胞內(nèi)的共定位情況。
　　6．免疫共沉淀實驗檢測 NICD1和其衍生肽段ΔNICD1（1773-2230）與NF-κBp50之間的相互作用。
　　結(jié)果：
　　1．成功

5、建立了 Flag標(biāo)簽融合的真核表達(dá)質(zhì)粒載體 p3xFlag-CMV-10-NICD1和p3xFlag-CMV-10-ΔNICD1，經(jīng)酶切、測序、表達(dá)分析檢測，確認(rèn)重組載體正確無誤。
　　2．EMSA實驗表明3xFlag-NICD1和3xFlag-ΔNICD1高表達(dá)的U251細(xì)胞內(nèi)N F-κB的靶DN A序列的結(jié)合活性均增強(qiáng)。
　　3．Western Blot檢測表明NICD1或ΔNICD1高表達(dá)的 U251細(xì)胞內(nèi)的p50和p

6、65蛋白表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)。細(xì)胞核內(nèi)的p50和p65水平較對照組顯著增加。
　　4．細(xì)胞免疫熒光染色觀察見NICD1或ΔNICD1高表達(dá)的U251細(xì)胞內(nèi)的p50和p65有明顯的核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，同時也觀察到NICD1或ΔNICD1與p50在核內(nèi)呈明顯的共定位現(xiàn)象。
　　5．免疫共沉淀實驗顯示 Notch1胞內(nèi)段NICD1和其衍生肽段ΔNICD1（1773-2230）與NF-κBp50之間存在相互作用關(guān)系。
　　結(jié)論：