TNF-α通過NF-κB調(diào)控TWIST表達誘導(dǎo)下咽癌Fadu細胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、第一部分 TWIST誘導(dǎo)下咽癌FaDu細胞發(fā)生EMT并促進其轉(zhuǎn)移的機制研究
　　實驗?zāi)康?一方面探討TWIST的表達變化對下咽癌FaDu細胞發(fā)生上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及其促進下咽癌FaDu細胞發(fā)生遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制;另一方面探討TWIST在下咽癌組織中的表達及其與臨床病理資料的關(guān)系。實驗方法:體外實驗部分，實驗分組為TWIST過表達載體組(pcDNA3.1-TWIST)及其對照組，TWIST沉默載體組(Mic

2、roRNA-TWIST)及其對照組，利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染下咽癌FaDu細胞，并利用Western blot的方法，驗證TWIST蛋白在上述兩種載體及對照組中的表達情況;利用倒置相差顯微鏡，觀察TWIST過表達對下咽癌FaDu細胞形態(tài)的影響;利用Transwell小室實驗，觀察TWIST過表達對下咽癌FaDu細胞的遷移和侵襲能力的影響;Western blot檢測TWIST過表達和沉默時分別對E-cadherin和N-cadherin表

3、達的影響;體內(nèi)實驗部分，采用免疫組織化學(xué)的方法，檢測TWIST在下咽癌腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況，并分析其表達與臨床病理資料（年齡，性別，腫瘤的大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。
　　實驗結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示:TWIST在pcDNA3.1-TWIST組中較對照組表達升高，在miR-TWIST組中較對照組表達降低;倒置顯微鏡觀察Fadu細胞的形態(tài)改變，結(jié)果顯示:在pcDNA3.1-TWIST組中，細胞表現(xiàn)為長條梭

4、形，細胞處于松散狀，細胞間的極性丟失，細胞間的粘附性降低;TranswellTM小室實驗發(fā)現(xiàn)，遷移實驗中，pcDNA3.1-TWIST組的細胞遷移數(shù)是對照組的1.8倍(P＜0.05)，表明TWIST過表達能增強Fadu細胞遷移能力;侵襲實驗中，pcDNA3.1-TWIST組中，細胞浸潤數(shù)是對照組的1.6倍(P＜0.05)，表明TWIST過表達同樣能增強Fadu細胞侵襲能力。檢測TWIST變化對E-cadherin和N-cadherin的

5、影響，Western blot結(jié)果顯示:在pcDNA3.1-TWIST組中，TWIST表達升高時，E-cadherin表達降低，N-cadherin升高;在miR-TWIST組表達，TWIST表達降低時，E-cadherin升高，N-cadherin表達降低，表明TWIST促進Fadu細胞發(fā)生了EMT。利用免疫組織化學(xué)的方法，檢測下咽癌組織和癌旁組織中TWIST的表達，結(jié)果顯示:TWIST在下咽癌組織中有表達，癌旁組織中未見表達。TWI

6、ST在下咽癌組織的細胞核和細胞質(zhì)均有表達，但細胞質(zhì)中表達更明顯;研究TWIST表達與臨床病理資料的關(guān)系，結(jié)果顯示:TWIST表達與下咽癌的分化(P=0.038)，腫瘤大小(P=0.048)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.044)有關(guān);而TWIST表達與病人性別、年齡無關(guān)(P＞0.050)。
　　實驗結(jié)論:本實驗，體外實驗首先證實了TWIST在pcDNA3.1-TWIST組中較對照組表達升高，在miR-TWIST組中較對照組表達降低，表明TW

7、IST過表達載體和沉默載體構(gòu)建成功并在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，其作為后續(xù)的基礎(chǔ)。TWIST的過表達能影響Fadu細胞的形態(tài)改變，并促進Fadu細胞的遷移和侵襲能力;TWIST變化導(dǎo)致E-cadherin和N-cadherin的表達變化，表明TWIST誘導(dǎo)Fadu細胞發(fā)生EMT;體內(nèi)實驗部分，研究發(fā)現(xiàn)TWIST在下咽癌組織中表達，且其表達與下咽癌組織的分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、性別無關(guān)。通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，TWIST的表達與下咽癌組

8、織的分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且能促進下咽癌Fadu細胞發(fā)生遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機制，是TWIST通過促進下咽癌發(fā)生EMT和調(diào)控E-cadherin和N-cadherin表達實現(xiàn)的。
　　第二部分 TNFα通過NF-κB通路調(diào)控TWIST表達誘導(dǎo)下咽癌Fadu細胞發(fā)生EMT的機制研究
　　實驗?zāi)康?上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，TNFα能促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機制可能與EMT的發(fā)生有

9、關(guān)。但是具體的機制并不清楚，所以，本實驗研究意在探討TNFα對下咽癌細胞Fadu發(fā)生EMT及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并深入闡釋其內(nèi)在可能的機制。
　　實驗方法:以下咽癌Fadu細胞為實驗材料， TNFα(10 ng/ml)處理組為實驗組，TNFα(10 ng/ml)未處理組為對照組。TNFα(10 ng/ml)作用Fadu細胞24 h，利用細胞劃痕-愈合實驗，檢測不同組細胞的運動能力，觀察TNFα(10 ng/ml)對FaDu細胞的運

10、動能力的影響;采用Transwell實驗，檢測不同組細胞的遷移和侵襲能力，觀察TNFα(10 ng/ml)對下咽癌FaDu細胞遷移和侵襲能力的影響;利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，探討TNFα(10 ng/ml)對下咽癌FaDu細胞形態(tài)的影響;利用細胞免疫熒光染色及共聚焦熒光顯微鏡檢測不同組中上皮間充質(zhì)標志物E-cadherin，N-cadherin表達，觀察TNFα(10 ng/ml)對E-cadherin，N-cadherin表

11、達的影響;為了進一步明確TNFα(10 ng/ml)對E-cadherin，Vimentin的影響，采用Western blot檢測TNFα(10g/ml)處理FaDu細胞不同時間(0h，1h，3h，5h)時E-cadherin，Vimentin的表達;為了進一步探討TNFα(10 ng/ml)對E-cadherin，Vimentin影響的機制，采用了Western blot和免疫熒光染色及共聚焦熒光顯微鏡，檢測TNF(10 ng/ml

12、)處理FaDu細胞不同時間(0h，1h，3h，5h)時TWIST，p65的表達變化;為了研究TNFα對p65的影響，同時檢測TNFα(10ng/ml)處理FaDu細胞不同時間(0h，1h，3h，5 h)時p-Ikk及p-Iκ Bα表達變化;為了研究p65對TWIST的影響，利用NF-κB特異性抑制劑(BAY11-7082)和siRNA-p65質(zhì)粒，降低p65表達，同時利用Western blot檢測各組中TWIST的表達變化。
　

13、　實驗結(jié)果:TNFα作用細胞24 h后，TNFα處理組中，細胞的運動速度比對照組明顯加快;遷移實驗中，處理組和對照組細胞數(shù)分別是276±38，124±15，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;浸潤實驗中，TNFα處理組和對照組細胞數(shù)分別是95±3，63±6，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;TNFα(10 ng/ml)作用后，F(xiàn)adu細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，TNFα處理組的細胞極性丟失，細胞呈長梭形，分散狀，細胞間的粘附性降低等間充質(zhì)細

14、胞表型，而對照組細胞呈橢圓形，細胞間排列緊密，細胞間的粘附性高。此外，免疫熒光及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TNFα處理組中，上皮標志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標志物Vimentin和N-cadherin表達升高;TNFα(10 ng/ml)作用Fadu細胞不同時間(0h，1h，3h，5h)后，利用Western blot檢測作用不同時間的TWIST表達，結(jié)果顯示隨著作用時間的延長，TWIST的表達升高;TNFα(10 ng

15、/ml)作用Fadu細胞不同時間(0h，1h，3h，5h)后，利用Western blot檢測作用不同時間的p65，p-Ikk和p-IκBα的表達，結(jié)果顯示:隨著作用時間的延長，其表達均升高;免疫熒光和Western blot檢測p65和TWIST表達，結(jié)果顯示:與對照組比較，實驗組核內(nèi)p65和TWIST表達升高;利用siRNA-p65和BAY11-7082降低p65表達，Western blot檢測p65和TWIST表達，結(jié)果顯示:s

16、iRNA-p65和BAY11-7082均能降低p65表達，p65降低的同時TWIST表達降低。
　　實驗結(jié)論:TNFα能夠促進FaDu細胞運動，遷移及浸潤能力;TNFα能誘導(dǎo)FaDu細胞形態(tài)由細胞間排列緊密、橢圓形，極性存在的上皮樣表型，向細胞松散、呈梭形、極性丟失的間充質(zhì)表型變化，同時伴有上皮標志物E-cadherin降低，間充質(zhì)標志物Vimentin和N-cadherin表達升高，表明TNFα誘導(dǎo)FaDu細胞發(fā)生具有較強遷移及