OPN對人OA軟骨細(xì)胞Fas表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:觀察不同病變程度的人OA關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞Fas的表達(dá)情況，并探討人軟骨中Fas的表達(dá)與軟骨退變嚴(yán)重程度之間可能存在的關(guān)系;探索重組OPN對人膝關(guān)節(jié)OA軟骨細(xì)胞Fas表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，為OA的防治提供新的思路。
　　方法:選取25例行全膝人工關(guān)節(jié)置換術(shù)OA患者的軟骨標(biāo)本，7例正常軟骨標(biāo)本來自年輕健康患者車禍意外行截肢術(shù)后。將各軟骨標(biāo)本采用常規(guī)HE染色，參照Freemont分度法將軟骨退變分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ度。應(yīng)用免疫組織化學(xué)

2、染色法檢測軟骨標(biāo)本中Fas的表達(dá)情況。
　　從人OA軟骨標(biāo)本和正常軟骨標(biāo)本分離并培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，將正常軟骨細(xì)胞組（A組）予以溶媒干預(yù)作對照，OA軟骨細(xì)胞分為B、C、D三組，分別予以溶媒、OPN siRNA基因干擾和人重組OPN進(jìn)行干預(yù);設(shè)計合成OPN siRNA并轉(zhuǎn)染人OA軟骨細(xì)胞，檢測其轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染人OA軟骨細(xì)胞后細(xì)胞OPN的表達(dá)水平;各組軟骨細(xì)胞在接受干預(yù)前，共同孵育24小時，干預(yù)48小時后，分別應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色(ICC

3、staining)、Western blotting及qRT-PCR檢測各組軟骨細(xì)胞Fas蛋白及mRNA表達(dá)水平;同時應(yīng)用MTT、AnnexinⅤ-FITC&PI凋亡檢測及TUNEL檢測各組軟骨細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)組OA軟骨標(biāo)本大體觀察及HE染色鏡下觀察結(jié)果顯示OA軟骨退變較正常軟骨明顯嚴(yán)重。2、Fas免疫組化染色示正常軟骨中Fas染色陽性的細(xì)胞較少，且主要集中于軟骨的表層和中層;而OA軟骨的軟骨表層、中層和深層均有

4、軟骨細(xì)胞被染成黃色或黃棕色，OA軟骨細(xì)胞Fas表達(dá)陽性率較高。3、OPN siRNA通過LipofectamineTM2000可順利轉(zhuǎn)染人OA軟骨細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率大于90％，且轉(zhuǎn)染OA軟骨細(xì)胞48小時后細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)水平下降71.6％。4、ICC染色顯示A組和C組細(xì)胞染色較淺，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)/膜被均勻地染成藍(lán)灰色，而B組細(xì)胞與A組和C組比較則染色較深，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)/膜被染成黃色，D組細(xì)胞染色較B組進(jìn)一步加深，細(xì)胞質(zhì)/膜被

5、染成棕黃色。5、WesternBlotting檢測A、B、C、D各組軟骨細(xì)胞的Fas蛋白表達(dá)結(jié)果分別為: A組81.710±4.3799， B組143.811±15.7128， C組53.893±3.0975，D組182.204±22.1973，B組與A組比較軟骨細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)存在顯著差異(p=0.01，p＜0.05)，C組與B組比較(p=0.001)以及D組與B組比較(p=0.009)也均存在顯著差異(p＜0.05);應(yīng)用qRT-

6、PCR檢測A、B、C、D各組軟骨細(xì)胞FasmRNA的表達(dá)結(jié)果分別為:A組1.390±0.2422，B組3.919±0.2919，C組1.106±0.1256，D組4.613±0.1315，B組與A組(p=0.001)比較軟骨細(xì)胞Fas mRNA表達(dá)存在顯著差異(p＜0.05)，C組與B組比較(p=0.001)以及D組與B組比較(p=0.004)也均存在顯著差異(p＜0.05)。6、MTT法檢測結(jié)果顯示:以A組正常軟骨細(xì)胞作為對照（存活率

7、100％），B、C、D各組的軟骨細(xì)胞存活率分別為:B組93.5％，C組99.4％，D組81.9％; AnnexinⅤ-FITC&PI凋亡檢測A、B、C、D各組軟骨細(xì)胞早期凋亡率結(jié)果為:A組1.420±0.1778％，B組8.710±0.1588％，C組4.057±0.2055％，D組17.950±0.8324％，各組的總凋亡率分別為:A組3.763±0.1331％，B組12.473±0.2318％，C組6.663±0.2479％，D組2

8、1.257±0.1950％，B組軟骨細(xì)胞與A組軟骨細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率均存在顯著差異（p值均為0.001，p＜0.05），C組與B組比較（p值均為0.006）以及D組與B組(p值均為0.006)比較軟骨細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率也均存在顯著差異(p＜0.05);TUNEL法檢測A、B、C、D各組軟骨細(xì)胞凋亡率分別為:A組4.050±1.0204％， B組14.333±1.5275％，C組8.105±1.0342％，D組22.401±

9、2.4815％，B組軟骨細(xì)胞與A組軟骨細(xì)胞凋亡率存在顯著差異(p=0.001，p＜0.05)，C組與B組比較(p=0.006)以及D組與B組(p=0.006)比較軟骨細(xì)胞凋亡率存在顯著差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:1、OA軟骨細(xì)胞的Fas表達(dá)水平和軟骨細(xì)胞凋亡率均較正常軟骨細(xì)胞顯著增高。2、OA軟骨中Fas蛋白的高表達(dá)可能與OA軟骨損傷有關(guān)。3、重組OPN可以增強(qiáng)OA軟骨細(xì)胞Fas表達(dá)和軟骨細(xì)胞凋亡。4、OPN siRNA可以