MCM7基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞周期的影響機(jī)制探究.pdf

1、第一部分構(gòu)建慢病毒 RNA干擾載體沉默 MCM7基因的人肝癌 SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2細(xì)胞模型
　　目的：構(gòu)建穩(wěn)定沉默微小染色體維持蛋白7(mini-chromosome maintenance protein7,MCM7)基因的人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2細(xì)胞模型。
　　方法：通過(guò)構(gòu)建能夠沉默MCM7基因表達(dá)的慢病毒RNA干擾載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)染人肝癌SMMC-7721、MHCC

2、-97H、HepG2細(xì)胞，進(jìn)而沉默細(xì)胞中MCM7基因的表達(dá)。并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證MCM7基因的沉默效率。
　　結(jié)果：構(gòu)建出穩(wěn)定沉默MCM7基因的人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、HepG2細(xì)胞，經(jīng)驗(yàn)證MCM7基因表達(dá)在mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均下調(diào)。
　　結(jié)論：本研究中利用慢病毒載體和RNA干擾技術(shù)構(gòu)建的RNA干擾慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)篩選，能夠成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默MCM7基因人肝癌細(xì)

3、胞系。
　　第二部分篩選干擾 MCM7基因后人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞差異表達(dá)基因，并探究細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)情況
　　目的:探究MCM7基因在調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞周期中的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:采用人全基因組表達(dá)譜芯片,篩選穩(wěn)定沉默MCM7基因后的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中的差異表達(dá)基因,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選出的細(xì)胞周期通路中的差異表達(dá)基因及預(yù)測(cè)到可能參與MCM7調(diào)節(jié)機(jī)制的人泛素啟動(dòng)子

4、UBB(ubiquitin b)的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:通過(guò)人基因表達(dá)譜芯片篩選出穩(wěn)定沉默MCM7基因的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中，差異表達(dá)基因1010個(gè)。其中上調(diào)基因391個(gè),下調(diào)基因619個(gè)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要涉及生物大分子代謝、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等方面，參與胞吞、腫瘤相關(guān)通路、P53信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞周期等通路的改變。篩選出細(xì)胞周期通路中差異表達(dá)基因10個(gè)，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量P

5、CR證實(shí)，在沉默MCM7基因的人肝癌SMMC-7721、MHCC-97H、HwpG2細(xì)胞中，MCM7、SKP2、CCND1、TP53、MAD2L1、CDC45、CDK6、DBF4基因表達(dá)均發(fā)生下調(diào)；CDC25A基因在沉默MCM7基因后的SMMC-7721、HepG2細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，在沉默MCM7基因后的MHCC-97H細(xì)胞中表達(dá)未見(jiàn)差異；TTK基因在沉默MCM7基因后的SMMC-7721、MHCC-97H細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在沉默MCM7基