蜂毒素誘導人肝癌細胞周期阻滯及機制研究.pdf

1、一、研究目的及背景：
　　 原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有早期診斷難，治療手段少，病程進展快，病死率高等特點，被稱為“癌中之王”，給全社會帶來了沉重的疾病負擔和巨大的經(jīng)濟損失。目前肝癌最有效的治療手段是早期手術(shù)切除，但在我國大部分病人初次診斷時就已進入中晚期，且多伴嚴重肝硬化和肝功能異常，使手術(shù)治療受到極大限制。即便是成功實施手術(shù)切除的早期病人，肝癌術(shù)后復發(fā)率也很高，嚴重影響了患者的生存和總體治療效果。此外，放療、介

2、入治療和肝移植等治療方法雖然取得一定進展，但總體療效仍然不能令人滿意。這一方面可能與肝癌細胞的多藥耐藥基因有關(guān)，更重要的原因是肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟多因素的過程，涉及到細胞內(nèi)的一系列復雜的生物學變化。因而從理論上就可以判斷，僅僅針對單一環(huán)節(jié)的藥物或治療不可能取得理想的治療效果。即便是代表學科前沿方向的靶向治療藥物，因其作用機制靶向性過強，導致臨床適應(yīng)人群少，且極易出現(xiàn)藥物耐藥和毒副反應(yīng)，并未取得預期中的良好療效。因此，研發(fā)針對腫瘤發(fā)

3、生、發(fā)展多個環(huán)節(jié)的藥物或者研究多種不同機制的藥物聯(lián)合應(yīng)用的創(chuàng)新療法成為學科發(fā)展的一個重要方向。目前，抗腫瘤藥物常見機制包括抑制生長、誘導凋亡和壞死，誘導分化等。遺憾的是，目前常用的抗肝癌藥物中，多數(shù)抗瘤效果單一，療效并不明顯。因此，研發(fā)具有多重抗瘤功能的新藥，或者探索多藥聯(lián)合應(yīng)用的創(chuàng)新療法對于我國這樣一個肝癌的高發(fā)國度而言，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。
　　 細胞周期是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷

4、的整個過程，通常分為G1、S、G2和M期四個時相。細胞周期中每一事件都是有規(guī)律、精確地發(fā)生，并且在時間與空間上受到嚴格調(diào)控，該調(diào)控效應(yīng)對基因損傷的及時修復和抑制細胞的惡性增殖有重要意義。細胞周期蛋白(Cyclin)和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)兩大家族基因控制著細胞周期的進展。Cyclin通過與相應(yīng)CDK結(jié)合而激發(fā)后者的激酶活性，被活化的CDK磷酸化細胞周期相關(guān)底物，推動周期的進展。例如，Cyclin E-CDK2復合物推動細胞進入

5、S期，Cyclin B-CDK1復合物促進細胞進入M期。CDK受其抑制物CKI(CDK inhibitory protein)的負向調(diào)節(jié)。CKI包括Cip/kip和INK4a/ARF兩大基因家族，它們因能夠抑制腫瘤細胞惡性增值而被認為是抑癌基因。Cip/kip家族包括p21，p27和p57，它們通過與Cyclin-CDK復合物結(jié)合使其失活，p21通常由抑癌基因p53激活，而p27由一種生長抑制因子TGFβ激活；INK4a/ARF包括p1

6、6INK4a和p14ARF，前者能夠與CDK4結(jié)合而抑制其活性，后者能夠防止抑癌基因p53降解。CDK、Cyclin和CKI構(gòu)成了細胞周期調(diào)控的核心機制。
　　 近年來，細胞周期異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到國內(nèi)外研究的關(guān)注。研究表明，細胞的增殖、分化、衰老和凋亡均具有一定程度的細胞周期依賴性，幾乎所有的腫瘤都有細胞周期調(diào)控機制的破壞，導致細胞生長失控、分化受阻、凋亡異常的特征。鑒于細胞周期異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，

7、國外有學者曾提出腫瘤是一種“細胞周期性疾病”的概念。因此，調(diào)節(jié)和干預腫瘤細胞的細胞周期，阻滯其生長是目前腫瘤治療的重要策略之一。研究表明，抑制腫瘤細胞Cyclin的表達，上調(diào)CKI表達，均可選擇性的抑制腫瘤組織CDK的活性，阻止腫瘤細胞的異常增殖。因而，探索能夠特異性抑制腫瘤細胞周期的藥物是腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點之一。在這一領(lǐng)域，我國豐富的中醫(yī)藥資源能夠給我們提供廣闊的研究空間，很多中藥都已被證實具有抗腫瘤和細胞周期阻滯作用，但其詳細的

8、分子機制和作用機理缺乏深入翔實的探討和闡述。因此，運用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)從細胞周期阻滯角度探索抗腫瘤中藥的作用機制具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。
　　 在本科室以往工作的基礎(chǔ)上，我們選擇蜂毒的有效活性成分蜂毒素單體作為研究對象。蜂毒素(melittin)是蜂毒的主要活性成分，約占蜂毒干質(zhì)量的50％。蜂毒素單體是經(jīng)現(xiàn)代工藝從蜂毒中提取的有效活性成分，純度可達99％以上。它是由26個氨基酸組成的堿性多肽，其N端和C端分別具有疏水和親

9、水的生化基團，具有典型的兩性分子結(jié)構(gòu)，具有很好的水溶性。近年來隨著蜂毒分離、提取、純化技術(shù)的不斷提高，對蜂毒素的功能及作用機制的研究也日益廣泛。目前的研究主要集中在蜂毒素的抗炎作用上，有研究表明蜂毒素能夠通過與NF-kB上游的IkB作用從而抑制NF-kB的活性發(fā)揮抗炎作用；也有報道認為蜂毒素能夠通過與NF-kB的P50亞基相互作用從而起到抗炎效應(yīng)；蜂毒素對體內(nèi)外支原體和衣原體引起的感染也均有抑制作用。我們以前的研究結(jié)果證明，攜帶蜂毒素的

10、重組腺病毒在體外能夠抑制肝癌細胞的生長；蜂毒素單體能夠抑制腫瘤組織血管生成，且可通過調(diào)節(jié)Rac1依賴的信號通路來抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。進一步研究也表明蜂毒素單體對人肝癌細胞具有明顯的凋亡誘導作用，且能促進TRAIL誘導不敏感肝癌細胞出現(xiàn)明顯凋亡，相比于單獨的蜂毒素處理組和TRAIL處理組均有顯著差異。以上研究表明，蜂毒素具有比較廣泛的抗瘤活性，其抗瘤機制包括誘導凋亡、抑制轉(zhuǎn)移和血管生成等。在前期預實驗過程中，我們還觀察到蜂毒素在較低濃度下

11、也能夠抑制肝癌細胞生長，同時我們并沒有觀察到明顯的細胞凋亡或者壞死現(xiàn)象。我們利用流式細胞技術(shù)檢測低濃度蜂毒素刺激后人肝癌細胞的細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)蜂毒素能阻滯肝癌細胞周期進展，經(jīng)蜂毒素刺激后人肝癌細胞S期比例明顯增加。但是，蜂毒素誘導肝癌細胞周期阻滯的分子機制未見文獻報道，該阻滯效應(yīng)與蜂毒素抗瘤效應(yīng)的關(guān)系也未明晰。因此，我們設(shè)計本課題的主要研究目的為：1.觀察蜂毒素在較低濃度下對肝癌細胞有無周期阻滯效應(yīng)；2.探索蜂毒素對肝癌細胞周期阻滯效

12、應(yīng)的分子機制及其與抗瘤效應(yīng)的關(guān)系。
　　 二、研究方法：
　　 1、MTT法觀察較低濃度下，蜂毒素對人肝癌細胞的生長抑制作用；
　　 2、流式細胞儀檢測蜂毒素誘導人肝癌細胞周期阻滯效應(yīng)及其劑量關(guān)系；
　　 3、Western-blot檢測蜂毒素刺激后參與細胞周期調(diào)控的相關(guān)基因在蛋白水平表達的改變情況，初步探討蜂毒素誘導周期阻滯的分子機制。
　　 三、研究結(jié)果：
　　 (一)MTT法觀察到蜂

13、毒素在較低濃度下(0.5-5.0ug/m1)對多種肝癌細胞(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)有生長抑制作用。當藥物濃度達到5ug/ml、作用時間為24h，蜂毒素對三種腫瘤細胞的抑制均達到30％以上，且鏡下未觀察到明顯細胞壞死現(xiàn)象；
　　 (二)流式細胞儀技術(shù)檢測蜂毒素能夠誘導多種人肝癌細胞(HepG2、Hep3B、SMMC-7721)S期阻滯。當藥物濃度達到5ug/ml、作用時間為48h，三種細胞S期比例均上升10個

14、百分點以上，且未觀察到明顯的細胞凋亡峰；
　　 (三)Western-Blot技術(shù)檢測蜂毒素刺激細胞30分鐘后，P53、P21、Rb蛋白表達無明顯改變，CyclinE、CDK2表達也無明顯改變，CyclinA、CyclinD1表達減少，P27表達增加。已知CyclinA和CyclinD1是細胞周期進展的正向調(diào)控因子，尤其是前者是細胞順利通過S期必須的周期蛋白，在該期其表達水平達到峰值。同時，P27因能夠與Cyclin-CDK復合