PNPLA3基因I148M多態(tài)性對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突變型的Huh-7細(xì)胞株，在此基礎(chǔ)上探討PNPLA3基因 I148M多態(tài)性對(duì)人Huh-7細(xì)胞周期的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：雙酶切PNPLA3基因野生型及PNPLA3基因 I148M突變型的基因序列與載體序列，并使目的基因分別與載體連接，純化并擴(kuò)增獲得含有目的基因的載體質(zhì)粒；獲得的載體質(zhì)粒和病毒輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得攜帶目的基因的高滴度的慢病毒；慢

2、病毒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，篩選并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突變型的Huh-7細(xì)胞株；在此基礎(chǔ)上以空載體Huh-7細(xì)胞為對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的Huh-7細(xì)胞周期，Western blot方法及熒光定量PCR分別檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子 Cyclin D1及p53的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，定量資料的數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)；P<0.05為

3、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：（1）成功構(gòu)建載體質(zhì)粒：陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)載體質(zhì)粒攜帶目的基因完整編碼序列。（2）慢病毒載體構(gòu)建成功并獲得足夠滴度（1×10^8 PFU/ml）的慢病毒載體：倒置熒光顯微鏡下顯示攜帶目的基因的慢病毒載體在293T細(xì)胞中成功組裝，嘌呤霉素篩選后表達(dá)出明亮的綠色熒光蛋白。（3）慢病毒成功感染 Huh-7細(xì)胞：倒置熒光顯微鏡下顯示嘌呤霉素篩選后綠色熒光蛋白陽(yáng)性表達(dá)率>95％；Western

4、blot結(jié)果顯示突變型組與野生型組目的蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組；熒光定量 PCR結(jié)果顯示突變型組及野生型組PNPLA3 mRNA的相對(duì)表達(dá)（突變型166.65±117.25，野生型1149.55±278.17）分別明顯高于對(duì)照組（1.02±0.23，P<0.05）。（4）PNPLA3基因I148M多態(tài)性導(dǎo)致Huh-7細(xì)胞周期紊亂：三組間各細(xì)胞周期細(xì)胞所占比例（%）的兩兩比較顯示野生型組細(xì)胞周期 G1期（58.53±0.35），G2/M期

5、（24.87±0.60），S期（16.60±0.26）參數(shù)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)各期（G1期59.27±0.15；G2/M期24.23±0.31；S期16.50±0.26）之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；突變型組與野生型組相比,G1期細(xì)胞比例減少(突變型 G1期38.37±0.21，P<0.05),S期與 G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)增加(突變型 S期27.47±0.35，G2/M期34.17±0.15，P<0.05)。（5）周期相關(guān)蛋白P53表達(dá)顯著增強(qiáng)，Cy

6、clin D1表達(dá)水平無明顯差異：與對(duì)照組相比，突變型組的 P53 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)（對(duì)照組1.06±0.41，突變型組6.54±0.34；P<0.05）；野生型組P53 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.66±0.30，P>0.05）。Cyclin D1 mRNA各組中的相對(duì)表達(dá)量均無明顯差異（對(duì)照組1.00±0.10，野生型組1.06±0.03，突變型,1.11±0.04；P>0.05）。
　　結(jié)論：PNPLA