松花粉多糖硫酸酯化前后對肝癌細胞增殖與細胞周期的影響.pdf

1、本實驗室研究曾表明，馬尾松花粉多糖(PPM60)及其硫酸酯化衍生物(SPPM60)均能通過增強免疫抑制小鼠體內(nèi)S180肉瘤，且SPPM60作用更強。PPM60對體外培養(yǎng)的人白血病K562細胞有較強的抑制作用，而硫酸酯化多糖SPPM60卻降低了其抑制作用；PPM60抑制K562細胞的機制可能是升高細胞內(nèi)鈣離子和活性氧濃度，阻滯細胞于G0/G1期，并誘導K562細胞產(chǎn)生凋亡。本實驗擬以人肝癌細胞株HepG2為研究對象，考察多糖硫酸酯化前后對

2、人肝癌細胞增殖與細胞周期的影響，并對其體外抗腫瘤的作用機制進行初步探討，以期為馬尾松花粉多糖及其酯化物應用于腫瘤的輔助治療提供理論依據(jù)。實驗主要分為以下幾個部分。
　　一、馬尾松花粉多糖的提取、分離純化、酯化及鑒定:采用水煮醇沉法對1000g馬尾松花粉提取多糖，得到60％乙醇分級沉淀多糖(PPM60)為5.461g。采用Sephacryl S-400HR層析對PPM60分離純化，得到三種不同分子量的多糖組分，分別命名為PPM60-

3、A、PPM60-B、PPM60-C。采用氯磺酸-吡啶法對PPM60及各純化組分進行硫酸酯化改性，改性后分別命名為SPPM60、SPPM60-A SPPM60-B、SPPM60-C，用氯化鋇-明膠比濁法鑒定其硫酸根含量并計算取代度(DS)分別為1.611、1.4、1.45、0.968。紅外光譜顯示已具有硫酸酯鍵(C-O-S和S=O)的特征吸收峰，表明多糖已被硫酸酯化。
　　二、多糖酯化前后對HepG2細胞生長能力的影響:MTT法檢測

4、不同濃度SPPM60或 PPM60作用不同時間對人肝癌細胞株 HepG2增殖活力的影響。SPPM60對HepG2細胞的增殖有抑制作用，一定程度上具有劑量和時間依賴性。在200?g/mL和400?g/mL濃度下作用72h，SPPM60對HepG2細胞的抑制率分別為38。21％和39.16％。而PPM60對HepG2細胞沒有抑制作用，甚至在某些條件下有輕微的促增殖作用。比較了兩種不同取代度的SPPM60(SPPM60-1、SPPM60-2，

5、DS為1.226和1.611):在200?g/mL濃度下作用72h，對HepG2細胞的抑制率分別為40.25％和53.34％，高DS的抑制率與低DS相比，具有顯著性差異。
　　三、多糖酯化前后對HepG2細胞周期的影響:流式細胞技術檢測SPPM60-2或PPM60處理前后HepG2細胞周期分布的變化。SPPM60-2組較對照組G2/M期細胞比例顯著性增加，S期比例均顯著性減少，G0/G1期比例沒有明顯變化，細胞被阻滯在G2/M期。

6、PPM60組細胞周期變化很小。Real-time PCR結果顯示，SPPM60-2可以下調(diào)CDK1、CyclinB的mRNA表達水平和上調(diào)p53和p21的mRNA表達，與對照組相比具有顯著性差異，而PPM60處理組各基因的mRNA表達水平，與對照組相比差異不顯著。
　　四、多糖酯化前后對HepG2細胞分泌VEGF的影響:SPPM60-2與SPPM60B均能使HepG2細胞培養(yǎng)上清中VEGF的表達有不同程度的下調(diào)，分別與對照組和PP

7、M60組相比較，均具有極顯著性差異。
　　以上結果表明:(1)PPM60對HepG2細胞的增殖幾乎沒有什么影響，硫酸酯化以后產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，且高取代度的硫酸酯化多糖對HepG2細胞有較高的抑制率。(2)SPPM60-2抑制HepG2細胞增殖的機制是在轉錄水平上下調(diào)CDK1和CyclinB的mRNA表達和上調(diào)p53和p21的mRNA表達，使細胞周期阻滯于G2/M期，抑制細胞的分裂。(3)在HepG2細胞中，SPPM60-2