酵母相馬爾尼菲青霉黑素的生成和TYR基因的關系及次級代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、目的：⑴探索L-DOPA對酵母相馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)的作用，從觀察培養(yǎng)基的顏色、菌落形態(tài)和顏色、光學顯微鏡下形態(tài)和熒光定量PCR儀檢測目的基因酪氨酸酶基因（TYR）表達的角度初步探討不同培養(yǎng)基在有或無L-DOPA對酵母相馬爾尼菲青霉的作用。⑵建立同時測定黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素3種有效成分的量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法及檢測酵母相馬爾尼菲青霉(PM)能否產(chǎn)生如

2、黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素等次級代謝產(chǎn)物。
　　方法：①將2株馬爾尼菲青霉菌株分別在含和不含1.0 mM L-DOPA的沙氏培養(yǎng)基、腦心浸汁培養(yǎng)基(BHI）以及含10％的胎牛血清的高糖固體培養(yǎng)基（DMEM）進行酵母相避光培養(yǎng)3天,觀察菌落、培養(yǎng)基顏色及鏡下觀察形態(tài)學的變化以及熒光定量PCR測定酪氨酸酶基因（TYR）的表達。②采用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(2.1×50mm,1.8μm)

3、色譜柱；選擇含甲醇（A）-0.1%甲酸的水(B)為流動相，體積流量為O．3mI/min。在電噴霧電離正離子模式下采用MRM檢測。將PM標準株FRR和臨床人分離株GXMUDXR分別在含10%的胎牛血清的高糖液體培養(yǎng)基進行酵母相培養(yǎng)7天,經(jīng)前處理后檢測黃曲霉素、膠霉素、交沙霉素這三種有效成分。
　　結果：⑴2株受試菌株在沙氏固體培養(yǎng)基中37℃避光培養(yǎng)3天,含L-DOPA和不含L-DOPA的PM菌株菌落顏色均無明顯改變；⑵2株受試菌株在

4、腦心浸膏培養(yǎng)基(BHI)上37℃避光培養(yǎng)3天,不含L-DOPA培養(yǎng)基上的菌落較含L-DOPA培養(yǎng)基的菌落顏色淺；⑶2株受試菌株在含10%胎牛血清高糖固體培養(yǎng)基上37℃避光培養(yǎng)3天,不含L-DOPA培養(yǎng)基上的菌落顏色淺，而含L-DOPA培養(yǎng)基上的菌落顏色變黑，且含L-DOPA不含PM菌株的培養(yǎng)基顏色也變黑；⑷光學顯微鏡下觀察結果：2株受試菌株在沙氏培養(yǎng)基、含和不含L-DOPA的BHI培養(yǎng)基、含和不含L-DOPA的10%胎牛血清的DMEM上

5、37℃培養(yǎng)3天后，各個培養(yǎng)基上的PM酵母細胞的形態(tài)、大小基本一致,均未見到被染成黑色；⑸熒光定量PCR檢測酪氨酸酶基因的表達：a.BHI培養(yǎng)基組:含和不含L-DOPA的竹鼠分離株PM及臨床人分離株PM中TYR基因的表達量均高于同組沙氏培養(yǎng)基組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且同組中含L-DOPA的BHI組中TYR的表達量高于不含L-DOPA的BHI組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。b.含10%胎牛血清的DMEM組：結果顯示含和不

6、含L-DOPA的標準株PM及臨床株PM中TYR基因的表達量與同組沙氏培養(yǎng)基組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。且同組含和不含L-DOPA的10%胎牛血清的DMEM組相互比較，兩者TYR的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。⑹與標準品比較，酵母相馬爾尼菲青霉菌未檢測出與黃曲霉素、膠霉素類似的目標峰，但各個樣品甚至是空白對照，均出現(xiàn)與交沙霉素類似的目標峰，但強度遠遠小于標準品。
　　結論：①PM菌株在含有L-DOPA的BHI培