馬爾尼菲青霉Atf21和Phx1基因功能與角質(zhì)酶基因原核表達(dá)研究.pdf

1、馬爾尼菲青霉真菌(PM)是青霉真菌屬中唯一的一種溫度依賴(lài)性的雙相型條件致病真菌，它是馬爾尼菲青霉真菌病(PSM)的病原菌，25℃時(shí)以菌絲相生長(zhǎng)，在37℃體外培養(yǎng)或者感染人體后轉(zhuǎn)換為致病性酵母相生長(zhǎng);主要流行區(qū)域在東南亞地區(qū)，PM對(duì)免疫功能低下的患者感染性強(qiáng)，對(duì)感染者造成致命性的全身性感染。目前，馬爾尼菲青霉真菌雙相轉(zhuǎn)換和致病性的分子機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞感受外界信號(hào)后調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵分子，許多轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控基因表達(dá)的同時(shí)其基

2、因自身的表達(dá)會(huì)受到調(diào)控。深入研究轉(zhuǎn)錄因子及其調(diào)控基因功能探討馬爾尼菲青霉雙相轉(zhuǎn)換與致病性分子機(jī)制，可為馬爾尼菲青霉病防治和藥物開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的:
　　1、本課題組前期進(jìn)行的馬爾尼菲青霉菌鏈特異性轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，編碼含亮氨酸拉鏈(bZIP)的轉(zhuǎn)錄因子基因Atf21和編碼含有同源異型盒(homeobox)結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子基因Phx1在雙相轉(zhuǎn)換過(guò)程中差異表達(dá)顯著，本課題通過(guò)構(gòu)建馬爾尼菲青霉菌Atf21和Phx1基

3、因缺失突變體，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子基因Atf21和Phx1的功能進(jìn)行了初步研究，探討馬爾尼菲青霉雙相轉(zhuǎn)換與致病性分子機(jī)制，可為馬爾尼菲青霉病防治和藥物開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　2、本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)編碼角質(zhì)酶轉(zhuǎn)錄因子β亞基基因（Ctf1β）及其調(diào)控的角質(zhì)酶基因在酵母相表達(dá)顯著升高。本課題擬通過(guò)克隆馬爾尼菲青霉菌角質(zhì)酶的基因，構(gòu)建角質(zhì)酶原核表達(dá)重組菌，進(jìn)行角質(zhì)酶的活性鑒定與分析，獲得重組蛋白為進(jìn)一步制備馬爾尼菲青霉菌角質(zhì)酶抗體和探討該抗體在防

4、治馬爾尼菲青霉病中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法::
　　1、用實(shí)時(shí)熒光定量方法分析馬爾尼菲青霉菌株GXFF在雙相轉(zhuǎn)換過(guò)程中基因表達(dá)量和基因表達(dá)特征。
　　2、利用同源重組方法，構(gòu)建目的基因敲除突變株，然后與Spm4野生菌株進(jìn)行對(duì)比研究，初步研究和分析突變?nèi)笔Щ虻墓δ堋?br>　　3、通過(guò)引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增馬爾尼菲青霉菌角質(zhì)酶基因序列，構(gòu)建誘導(dǎo)型表達(dá)載體，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒的測(cè)序;用堿式滴定法測(cè)定酶活性;

5、提取蛋白對(duì)角質(zhì)酶進(jìn)行表達(dá)鑒定。
　　結(jié)果:
　　1、Atf21和Phx1基因在馬爾尼菲青霉菌雙相轉(zhuǎn)換不同時(shí)相的表達(dá)進(jìn)行分析結(jié)果表明，在馬爾尼菲青霉菌株GXFF中Atf21和Phx1基因表達(dá)在菌絲相生長(zhǎng)狀態(tài)顯著高于在酵母相生長(zhǎng)狀態(tài)，與在馬爾尼菲青霉菌株FRR2161中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析Atf21基因表達(dá)結(jié)果一致;Atf21在雙相轉(zhuǎn)換早期基因表達(dá)明顯改變，在雙向轉(zhuǎn)化過(guò)程中Phx1基因表達(dá)出現(xiàn)明顯改變時(shí)間較晚。
　　2、成功構(gòu)建

6、了Atf21和Phx1基因敲除菌株，與對(duì)照菌Spm4對(duì)比，Atf21突變菌株對(duì)Cu更加敏感，Phx1突變菌株對(duì)Cu的敏感性無(wú)影響。
　　3、成功克隆了馬爾尼菲青霉菌角質(zhì)酶基因，構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達(dá)載體并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證;構(gòu)建了馬爾尼菲青霉菌角質(zhì)酶基因大腸桿菌原核表達(dá)重組菌株;用堿式滴定法測(cè)定重組菌株酶活性約為對(duì)照菌1.7倍，粗酶液的酶活性可達(dá)21.8U/mL。
　　結(jié)論:
　　1、馬爾尼菲青霉菌Atf21和Phx1基因在雙相轉(zhuǎn)

7、換不同時(shí)相表達(dá)差異顯著，Atf21和Phx1基因表達(dá)在菌絲相生長(zhǎng)狀態(tài)顯著高于在酵母相生長(zhǎng)狀態(tài);Atf21在雙相轉(zhuǎn)換早期基因表達(dá)明顯改變，在雙向轉(zhuǎn)化過(guò)程中Phx1基因表達(dá)出現(xiàn)明顯改變時(shí)間較晚。
　　2、成功構(gòu)建了Atf21和Phx1基因敲除菌株，創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌轉(zhuǎn)錄因子基因Atf21具有調(diào)控銅離子代謝功能，為深入探討馬爾尼菲青霉雙相轉(zhuǎn)換與致病性分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　3、成功克隆了馬爾尼菲青霉菌角質(zhì)酶基因，構(gòu)建了馬