ELISA快速檢測艾滋病人血中馬爾尼菲青霉菌感染.pdf

1、背景和目的 馬爾尼菲青霉菌(Penicilliurn marneffei，P.m)是艾滋病患者常易感染的一種機會性致病真菌，為青霉屬中唯一的溫度依賴性雙相菌種。由其所致的馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis mameffei，PSM)是我國南方以及東南亞國家艾滋病人的常見死因。診斷馬爾尼菲青霉病主要依靠真菌培養(yǎng)及組織病理檢查；但前者常使時間延誤，后者有時易和其它巨噬細胞內病原體混淆。而一些新興的分子檢測方法如聚合酶鏈式反應

2、(polymerase chainreaction，PCR)、基因芯片等又由于種種原因目前尚不能在臨床上推廣使用，因此建立簡捷而敏感的檢測方法成為防治馬爾尼菲青霉病迫切需要解決的關鍵問題之一。為此，本研究利用前期已經制備好的P.m特異性抗體，通過建立酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)快速檢測血清中馬爾尼菲青霉菌抗原，以提高臨床診斷效率。 方法 (1)本課題組前

3、期與上海國家人類基因組南方研究中心合作已對P.m的功能基因組學進行了研究。通過cDNA文庫的構建和分析，發(fā)現了P.m的兩條可能編碼細胞壁蛋白的特異性新基因PYA_024_60和PYA_012_92，用這兩條基因經大腸桿菌表達的蛋白免疫新西蘭兔產生特異性多克隆抗體，其中PYA_012_92抗體特異性較高，用于本實驗的研究。(2)從檔案中選取23例經臨床和病理檢查證實為馬爾尼菲青霉感染病例，以及23例雜菌(其中曲菌14例、白色念珠菌2例、新

4、型隱球菌2例、毛霉菌2例、放線菌3例)感染病例的石蠟標本進行連續(xù)切片，分別進行蘇木素．伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色、過碘酸-雪夫氏(Periodic Acid Schiff，PAS)染色以及經淀粉酶消化后的PAS染色(D-PAS)，并用前述兔抗馬爾尼菲青霉抗體對上述組織切片進行免疫組化染色，以檢驗該抗體的特異性和粗步確定抗體效價；(3)采用過碘酸鈉法，給該抗體標記上辣根過氧化物酶并進行純化，用純化后的酶標

5、抗體與馬爾尼菲青霉病人血清做免疫瓊脂雙向擴散實驗，驗證酶標抗體的活性。(4)用特異性馬爾尼菲青霉抗體包被硝酸纖維膜，通過免疫斑點法對經真菌培養(yǎng)確診的艾滋病繼發(fā)馬爾尼菲青霉病人血清標本進行檢測，以摸索與之原理相同的EIASA法的實驗條件。(5)用特異性馬爾尼菲青霉抗體包被聚苯乙烯板，運用ELISA雙抗夾心法檢測103例艾滋病血清標本中馬爾尼菲青霉抗原并與免疫斑點法的檢測結果進行比較。 結果 (1)組織學和免疫組織化學結

6、果：23例馬爾尼菲青霉病例的基礎疾病均為艾滋病，可見淋巴結內淋巴細胞衰減，巨噬細胞大量增生，特殊染色可見酵母型真菌大量聚集于巨噬細胞胞質內，也有部分真菌在巨噬細胞外；在油鏡下觀察可見：P.m特征性的臘腸狀菌體和細胞內橫隔。免疫組化結果顯示，本實驗室前期制備的抗體能使其中22例馬爾尼菲青霉病組織切片里的Em顯棕黃色，陽性部位主要在細胞壁，但胞漿也有輕度著色；而其它幾種真菌和放線菌則呈陰性，這說明抗體具有很高的特異性。(2)酶標抗體的質量和

7、活性：辣根過氧化物酶與抗體的克分子比值為1.594(大于1.5)，酶與抗體的結合率為37.25％(大于30％)，質量較好；免疫雙擴散檢測酶標抗體有較好的抗體活性和酶活性。(3)免疫斑點法實驗條件的確立：經方陣法測得免疫斑點法中包被抗體的濃度為40μg/ml、待測血清的稀釋度為1:1、酶標抗體的濃度為1:40。(4)ELISA實驗條件的確立：經方陣法測得ELISA中包被抗體的濃度為20μg/ml、待測血清的稀釋度為1:2、酶標抗體的濃度為

8、1:20。(5)用免疫斑點法和ELISA法分別檢測103例AIDS患者病人血清，兩者馬爾尼菲青霉抗原檢測陽性率與金標準(真菌培養(yǎng))的差別無顯著意義；前者的靈敏度與符合率分別為75％和97.09％，后者的靈敏度與符合率分別87.5％和98.06％，ELISA優(yōu)于免疫斑點法。 結論： 1、用ELISA方法檢測患者血清中的馬爾尼菲青霉抗原較傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法更為快速、簡便，適用于臨床大量標本的檢測，易在基層醫(yī)院推廣使用。