ELISA快速檢測(cè)艾滋病人血中馬爾尼菲青霉菌感染.pdf

1、背景和目的 馬爾尼菲青霉菌(Penicilliurn marneffei，P.m)是艾滋病患者常易感染的一種機(jī)會(huì)性致病真菌，為青霉屬中唯一的溫度依賴性雙相菌種。由其所致的馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis mameffei，PSM)是我國南方以及東南亞國家艾滋病人的常見死因。診斷馬爾尼菲青霉病主要依靠真菌培養(yǎng)及組織病理檢查；但前者常使時(shí)間延誤，后者有時(shí)易和其它巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體混淆。而一些新興的分子檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

2、(polymerase chainreaction，PCR)、基因芯片等又由于種種原因目前尚不能在臨床上推廣使用，因此建立簡(jiǎn)捷而敏感的檢測(cè)方法成為防治馬爾尼菲青霉病迫切需要解決的關(guān)鍵問題之一。為此，本研究利用前期已經(jīng)制備好的P.m特異性抗體，通過建立酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)快速檢測(cè)血清中馬爾尼菲青霉菌抗原，以提高臨床診斷效率。 方法 (1)本課題組前

3、期與上海國家人類基因組南方研究中心合作已對(duì)P.m的功能基因組學(xué)進(jìn)行了研究。通過cDNA文庫的構(gòu)建和分析，發(fā)現(xiàn)了P.m的兩條可能編碼細(xì)胞壁蛋白的特異性新基因PYA_024_60和PYA_012_92，用這兩條基因經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的蛋白免疫新西蘭兔產(chǎn)生特異性多克隆抗體，其中PYA_012_92抗體特異性較高，用于本實(shí)驗(yàn)的研究。(2)從檔案中選取23例經(jīng)臨床和病理檢查證實(shí)為馬爾尼菲青霉感染病例，以及23例雜菌(其中曲菌14例、白色念珠菌2例、新

4、型隱球菌2例、毛霉菌2例、放線菌3例)感染病例的石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，分別進(jìn)行蘇木素．伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色、過碘酸-雪夫氏(Periodic Acid Schiff，PAS)染色以及經(jīng)淀粉酶消化后的PAS染色(D-PAS)，并用前述兔抗馬爾尼菲青霉抗體對(duì)上述組織切片進(jìn)行免疫組化染色，以檢驗(yàn)該抗體的特異性和粗步確定抗體效價(jià)；(3)采用過碘酸鈉法，給該抗體標(biāo)記上辣根過氧化物酶并進(jìn)行純化，用純化后的酶標(biāo)

5、抗體與馬爾尼菲青霉病人血清做免疫瓊脂雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證酶標(biāo)抗體的活性。(4)用特異性馬爾尼菲青霉抗體包被硝酸纖維膜，通過免疫斑點(diǎn)法對(duì)經(jīng)真菌培養(yǎng)確診的艾滋病繼發(fā)馬爾尼菲青霉病人血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以摸索與之原理相同的EIASA法的實(shí)驗(yàn)條件。(5)用特異性馬爾尼菲青霉抗體包被聚苯乙烯板，運(yùn)用ELISA雙抗夾心法檢測(cè)103例艾滋病血清標(biāo)本中馬爾尼菲青霉抗原并與免疫斑點(diǎn)法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 (1)組織學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)

6、果：23例馬爾尼菲青霉病例的基礎(chǔ)疾病均為艾滋病，可見淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞衰減，巨噬細(xì)胞大量增生，特殊染色可見酵母型真菌大量聚集于巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，也有部分真菌在巨噬細(xì)胞外；在油鏡下觀察可見：P.m特征性的臘腸狀菌體和細(xì)胞內(nèi)橫隔。免疫組化結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)室前期制備的抗體能使其中22例馬爾尼菲青霉病組織切片里的Em顯棕黃色，陽性部位主要在細(xì)胞壁，但胞漿也有輕度著色；而其它幾種真菌和放線菌則呈陰性，這說明抗體具有很高的特異性。(2)酶標(biāo)抗體的質(zhì)量和

7、活性：辣根過氧化物酶與抗體的克分子比值為1.594(大于1.5)，酶與抗體的結(jié)合率為37.25％(大于30％)，質(zhì)量較好；免疫雙擴(kuò)散檢測(cè)酶標(biāo)抗體有較好的抗體活性和酶活性。(3)免疫斑點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)條件的確立：經(jīng)方陣法測(cè)得免疫斑點(diǎn)法中包被抗體的濃度為40μg/ml、待測(cè)血清的稀釋度為1:1、酶標(biāo)抗體的濃度為1:40。(4)ELISA實(shí)驗(yàn)條件的確立：經(jīng)方陣法測(cè)得ELISA中包被抗體的濃度為20μg/ml、待測(cè)血清的稀釋度為1:2、酶標(biāo)抗體的濃度為

8、1:20。(5)用免疫斑點(diǎn)法和ELISA法分別檢測(cè)103例AIDS患者病人血清，兩者馬爾尼菲青霉抗原檢測(cè)陽性率與金標(biāo)準(zhǔn)(真菌培養(yǎng))的差別無顯著意義；前者的靈敏度與符合率分別為75％和97.09％，后者的靈敏度與符合率分別87.5％和98.06％，ELISA優(yōu)于免疫斑點(diǎn)法。 結(jié)論： 1、用ELISA方法檢測(cè)患者血清中的馬爾尼菲青霉抗原較傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法更為快速、簡(jiǎn)便，適用于臨床大量標(biāo)本的檢測(cè)，易在基層醫(yī)院推廣使用。