馬爾尼菲青霉次級代謝產物對巨噬細胞功能的影響.pdf

1、目的：觀察馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)次級代謝產物對小鼠巨噬細胞株RAW264.7形態(tài)、活力和極化功能的影響，從形態(tài)學、細胞生物學和免疫學角度初步探討馬爾尼菲青霉次級代謝產物在病原體逃避宿主免疫防御中的作用。
　　方法：分離提取PM酵母樣細胞在DMEM液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)的濾液，培養(yǎng)濾液與巨噬細胞RAW264.7共同培養(yǎng):(1)光學顯微鏡觀察PM培養(yǎng)濾液對巨噬細胞生長形態(tài)的影響。(2)糖原染

2、色（PAS染色）觀察PM培養(yǎng)濾液對巨噬細胞吞噬PM分生孢子能力的影響;(3) WST-8法檢測PM培養(yǎng)濾液對巨噬細胞的毒性及增殖影響程度;(4) AnnexinⅤ-FITC/PI流式細胞術檢測PM培養(yǎng)濾液對巨噬細胞凋亡、壞死的影響程度;(5) ELISA法檢測PM培養(yǎng)濾液對巨噬細胞分泌細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10）的影響;(6)免疫熒光細胞化學法檢測PM培養(yǎng)濾液對巨噬細胞表面標志CD16/32、CD206表達

3、情況的影響。
　　結果：(1) PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細胞RAW264.724 h～48 h，巨噬細胞生長密度降低，體積變大，腫脹變圓，部分胞漿內見空泡，少許細胞崩解。(2)10％～50％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細胞，24 h時，實驗組巨噬細胞吞噬PM分生孢子的吞噬率(％)和吞噬指數分別為83.687±6.279，5.969±1.170;48h時，吞噬率(％)和吞噬指數分別為78.402±5.522，6.602±0.784;24

4、h、48 h吞噬率和吞噬指數分別與對照組比較均有顯著升高(P＜0.05)。(3)10％～40％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細胞24 h、48 h，WST-8檢測實驗組巨噬細胞OD值分別為0.996±0.152，0.564±0.269，與對照組比較均有顯著降低（24 h，P＜0.05;48h，P＜0.001）。流式細胞術檢測細胞凋亡壞死:實驗組巨噬細胞存活細胞率(％)、凋亡率(％)和壞死率(％)在24 h時，分別為76.41±10.99，9.

5、13±4.10，11.03±8.34;48 h時，分別為58.91±21.00，13.18±5.51，18.14±12.73;24h、48 h存活率分別與對照組比較均有顯著降低（P＜0.05）;凋亡率有顯著升高（P＜0.05）;壞死率無統計學意義(P＞0.05)。(4)10％～60％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細胞，24 h時，實驗組巨噬細胞TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10濃度(pg/ml)分別為1807.300±193.75

6、9，4.769±3.736，3.180±1.141，35.431±16.005;與對照組比較TNF-α、IL-10、IL-12分泌量均有顯著升高(P＜0.05)，IL-1β分泌量顯著減少(P＜0.01)。48 h時，實驗組TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10濃度分別為1491.307±695.238，7.153±4.128，4.084±1.631，20.878±11.696，與對照組比較TNF-α、IL-10分泌量均有顯著升高

7、(P＜0.01)，IL-1β分泌量顯著減少(P＜0.01)，IL-12差異無統計學意義(P＞0.05)。(5)免疫熒光細胞化學觀察20％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細胞，表達CD206，不表達CD16/32;巨噬細胞與PM分生孢子共同培養(yǎng)，同樣僅表達CD206。
　　結論：(1) PM培養(yǎng)濾液中含有的次級代謝產物可以激活巨噬細胞表達CD206和分泌細胞因子TNF-α、IL-10。(2) PM次級代謝產物作用于巨噬細胞的早期(24 h～