馬爾尼菲青霉生物學特性研究及其差異表達基因的篩選和鑒定.pdf

1、馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)，屬真菌界，半知菌亞門，絲孢菌綱，絲孢目，青霉屬，雙輪青霉亞屬。馬爾尼菲青霉感染人體后引起的一種嚴重的深部真菌病——馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，PSM)。自DiSalvo首例報道之后，此真菌感染導致的疾病開始逐漸引起人們的重視。該病的發(fā)生有一定地域性，在艾滋病流行以前，較為罕見，主要在東南亞地區(qū)如泰國、越南、柬埔寨、老撾、香港和我國廣西等

2、地。近20年來隨著免疫抑制劑的廣泛應用、器官移植、AIDS等所導致的免疫缺陷宿主不斷增多，馬爾尼菲青霉病的報道也日漸增多，而且發(fā)病區(qū)域有擴大趨勢。僅廣州已發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉病例近百余例，其中約50﹪以上與AIDS相關，已成為繼廣西省之后我國第二大馬爾尼菲青霉病的重要流行區(qū)域。由于該病發(fā)病隱匿，病死率高達80﹪以上，并與AIDS高度相關，危害極大，所以已引起國內(nèi)外真菌專家的重視。 馬爾尼菲青霉是青霉屬300多種青霉中唯一的雙相型真菌

3、，25℃生長為菌絲相，以無性孢子的方式繁殖；37℃則呈酵母相，以分裂的方式繁殖，至今未發(fā)現(xiàn)它的有性生殖期。馬爾尼菲青霉的自然宿主為竹鼠及其洞穴周圍的土壤，但它如何從自然界傳播給人類尚未清楚。目前認為馬爾尼菲青霉感染人體的可能的途徑為孢子經(jīng)呼吸道進入宿主，然后在人體37℃的環(huán)境下發(fā)生雙相型轉(zhuǎn)變產(chǎn)生致病性的酵母細胞，在免疫缺陷患者中侵范單核-巨嗜細胞系統(tǒng)并引起播散。在馬爾尼菲青霉雙相型轉(zhuǎn)換中有以下兩點是值得關注的，其一，在溫度的誘導下，其酵

4、母相與菌絲相之間可以兩種形態(tài)相互轉(zhuǎn)換，既可以從菌絲向酵母轉(zhuǎn)換，也可以從酵母向菌絲轉(zhuǎn)換。其二，分生孢子從呼吸道侵入宿主，肺泡巨噬細胞將之吞噬，分生孢子直接轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍讣毎?，并沒有經(jīng)歷從分生孢子出芽形成菌絲的過程。這些說明馬爾尼菲青霉雙相型轉(zhuǎn)換受一系列溫度變化開啟的基因調(diào)控，其在體內(nèi)的致病形式為酵母細胞，但具體的調(diào)控機制和毒力基因尚不明確。已有研究表明馬爾尼菲青霉的致病性與其雙相型轉(zhuǎn)變密切相關。這兩種生長形態(tài)的改變可以使一些基因的表達水平發(fā)生

5、改變，以調(diào)節(jié)馬爾尼菲青霉細胞的分化及形態(tài)的轉(zhuǎn)變。一些有可能在雙相型轉(zhuǎn)變中起關鍵作用基因被詳細的研究，如abaA基因，cflA(CDC42 homolog)基因和TupA基因等，這些研究對其形態(tài)形成的分子機制具有一定的提示作用，但尚未發(fā)現(xiàn)對雙相型轉(zhuǎn)換起直接調(diào)控作用的基因。所以全面而細致的尋找馬爾尼菲青霉雙相間的差異性表達基因有可能為揭開馬爾尼菲青霉形態(tài)轉(zhuǎn)變的秘密及進一步尋找其致病相關基因提供一些幫助。 抑制消減雜交技術(suppr

6、ession subtractive hybridization，SSH)主要通過消減雜交將待比較雙方共同的cDNA進行消減，再通過抑制性PCR技術擴增在Tester中特異表達的cDNA片段，使其得到大量富集。抑制性消減雜交技術是當今研究基因差異表達最為有效的工具之一。迄今為止，已經(jīng)廣泛的應用于腫瘤、植物及致病真菌等的研究中。 本課題以馬爾尼菲青霉的雙相性轉(zhuǎn)換為切入點，除了介紹馬爾尼菲青霉的生物學特性及分子生物學鑒定方法外，還將

7、SSH技術應用于尋找馬爾尼菲青霉菌絲相與酵母相的差異表達基因的研究中，為進一步尋找其致病相關基因、探討致病性作一些基礎研究，也希望為馬爾尼菲青霉病的致病機制深入研究提供一些資料。 第一部分馬爾尼菲青霉生物學特性研究及分子生物學鑒定方法。 1.1馬爾尼菲青霉生物學特性研究馬爾尼菲青霉在五種培養(yǎng)基上的生長情況：將馬爾尼菲青霉菌株SUMS0152、SUMS0050、SUMS0215、SUMS0222接種于SDA、PDA、BHI

8、、CDA、CMA五種不同的培養(yǎng)基上，然后分別放置在25℃和37℃培養(yǎng)兩周。在25℃，四株馬爾尼菲青霉在五種培養(yǎng)基上均生長良好，但在不同培養(yǎng)基上生長速度，色素產(chǎn)生情況，菌落形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)有所不同。在37℃，馬爾尼菲青霉均生長為酵母狀菌落，無色素產(chǎn)生，但在不同的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化為酵母細胞的能力不同。馬爾尼菲青霉在SDA培養(yǎng)基上不同溫度下的生長情況：四株馬爾尼菲青霉在6℃和10℃菌落生長減慢，產(chǎn)生色素減少，18℃及28℃生長良好，產(chǎn)生大量紅色

9、色素。在37℃為酵母狀菌落，生長較快，但容易死亡，在40℃未發(fā)現(xiàn)生長。 放線菌酮耐受試驗：四株馬爾尼菲青霉在含有放線菌酮(濃度0.1﹪，0.05﹪)的SDA培養(yǎng)基上25℃和37℃均未見生長，在含0.01﹪放線菌酮的培養(yǎng)基上緩慢生長。 尿素酶產(chǎn)生情況：四株馬爾尼菲青霉在37℃的尿素酶試驗均為陰性。 1.2馬爾尼菲青霉的ITS序列測定采用來源于真菌核糖體大亞基基因保守區(qū)的通用引物ITS5和ITS4，PCR擴增四株馬爾

10、尼菲青霉的rDNAITS區(qū)。四株馬爾尼菲青霉的均能擴增出600bp左右的片段，將PCR產(chǎn)物進行測序，序列在Genbank中應用Blastn進行查詢，所有菌株均與馬爾尼菲青霉的標準株具有100﹪同源性。ITS序列分析是一種快速、準確的鑒定馬爾尼菲青霉的分子生物學方法。 第二部分馬爾尼菲青霉抑制性消減文庫的建立。 1.1馬爾尼菲青霉總RNA提取方法的比較利用Rneasy Plant Mini Kit，Trizol，改良的異硫

11、氰酸胍法，RNAex四種方法提取馬爾尼菲青霉雙相的總RNA，以尋找一種合適的方法用于建立抑制性消減文庫。結(jié)果顯示四種方法提取的RNA均較為完整，但相同重量的菌體所提取的RNA產(chǎn)量、質(zhì)量及所用時間和價格皆有差異。通過比較，發(fā)現(xiàn)Trizol提取的RNA具有完整性和純度均較好，產(chǎn)量較高，操作相對簡便，價格適中等優(yōu)點，可用于有效的建立抑制性消減文庫。 1.2馬爾尼菲青霉抑制性消減文庫的建立利用SMART技術將馬爾尼菲青霉菌絲相和酵母相的

12、總RNA合成cDNA并進行Rsal酶切。然后應用抑制性消減雜交技術(SSH)，連接不同的接頭，通過兩輪雜交和兩次抑制性PCR后，將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)染大腸桿菌。經(jīng)PCR鑒定，共得到1200余條插入片段。成功構(gòu)建了馬爾尼菲青霉的正向消減文庫(以酵母相為tester，菌絲相為driver)和反向消減文庫(以菌絲相為tester，,酵母相為driver)。 第三部分馬爾尼菲青霉差異表達基因的篩選及初步功能研究。

13、從馬爾尼菲青霉正向消減文庫和反向消減文庫選取500個cDNA片段進行cDNA斑點雜交。共在正向文庫中篩選出46個陽性克隆，反向文庫中篩選出35個陽性克隆。經(jīng)測序分析及Blastx查詢，這些基因按其功能可以分為細胞壁合成、信號轉(zhuǎn)導、細胞循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、基礎代謝、應激反應等幾大類。應用相對定量real-time PCR寸六個代表性基因進行了進一步的研究。我們推測在溫度改變時，馬爾尼菲青霉的信號傳導通路被開啟，相應的基因表達上調(diào)，這些基因決定