MicroRNA-34b-5p調(diào)控發(fā)育期驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡及其機制的研究.pdf

1、第一部分發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬miRNA差異表達譜分析
　　目的：篩選發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬差異表達的miRNAs，為進一步探討miRNA在發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生機制中的作用提供依據(jù)。
　　方法：健康清潔20日齡SD大鼠16只，隨機分為正常對照組和驚厥組，每組8只大鼠。三氟乙醚反復吸入（每天一次，連續(xù)6天）制作發(fā)育期驚厥模型，對照組除不吸入三氟乙醚外，其他處理同驚厥組。反復驚厥后1d大鼠斷頭取腦，分離海馬組織，提取總RN

2、A進行逆轉(zhuǎn)錄，TaqMan(R)MicroRNA Array方法篩選出驚厥組與對照組大鼠海馬差異表達的miRNAs，并利用實時定量PCR對部分差異表達的miRNAs進行二次驗證。
　　結果：TaqMan(R)MicroRNA Array檢測發(fā)現(xiàn)有30個miRNAs在驚厥組和對照組海馬組織中表達差異顯著，差異倍數(shù)大于2倍以上。其中9個miRNAs上調(diào)，21個miRNAs下調(diào)。上調(diào)顯著的miRNAs有:miR-34b-5p、miR-2

3、04等;下調(diào)顯著的有miR-582-3p，miR-672等。實時定量PCR對差異表達的miR-34b-5p、miR-204、miR-582-3p、miR-672進行驗證，結果與TaqMan低密度芯片結果趨勢一致，表明芯片結果可靠，提示miR-34b-5p、miR-204等miRNAs參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷的發(fā)生過程。
　　結論：MiR-34b-5p、miR-204等部分miRNAs在發(fā)育期驚厥組和正常對照海馬組織中存在顯著差異表

4、達，提示它們可能參與了發(fā)育期驚厥性腦損傷發(fā)生的分子機制。
　　第二部分 MicroRNA-34b-5p及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在驚厥后海馬的動態(tài)表達及意義
　　目的：研究發(fā)育期大鼠反復驚厥后海馬組織miR-34b-5p及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的動態(tài)表達變化，探討miR-34b-5p在發(fā)育期驚厥性腦損傷后海馬神經(jīng)細胞凋亡中的作用。
　　方法：96只20日齡健康Spr

5、ague-Dawley(SD)大鼠隨機分為2組:正常對照組和驚厥組。通過三氟乙醚反復吸入（連續(xù)6次，每天1次）制作發(fā)育期大鼠驚厥動物模型。用qRT-PCR方法檢測反復驚厥后2h、6h、1d、3d、7d海馬組織中miR-34b-5p的表達;Western Blot方法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達。
　　結果：(1)實時定量PCR結果顯示，反復驚厥后2h-1d海馬miR-34b-5p的表達均較對照組顯著

6、增高(P＜0.01)，3d、7d時逐漸恢復至正常水平(P＞0.05)。(2) Western blot結果顯示，反復驚厥后2h大鼠海馬Bcl-2蛋白水平與對照組相比無顯著變化(P＞0.05)，6h較對照組顯著降低，1d時進一步下調(diào)，7d時下降最顯著(P＜0.01);而反復驚厥后Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達呈現(xiàn)相反的趨勢，反復驚厥后2h大鼠海馬Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白水平較

7、對照組顯著升高，6h表達量更高，1d時升高最明顯，3d、7d時仍顯著高于對照組(P＜0.01);Bax/Bcl-2的比值在反復驚厥后各時間點皆顯著高于對照組（P＜0.01）。
　　結論：反復驚厥后早期海馬miR-34b-5p的表達顯著增強，同時伴有促凋亡相關基因Bax、Caspase-3活性蛋白的表達增強，Bax/Bcl-2的比值升高，而抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達降低，提示miR-34b-5p可能在發(fā)育期驚厥性腦損傷后早期神經(jīng)

8、細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　第三部分 MicroRNA-34b-5p的靶基因預測及驗證
　　目的：預測并驗證miR-34b-5p作用的靶基因，進一步了解miR-34b-5p的生物學功能及在發(fā)育期驚厥性腦損傷中的作用機制。
　　方法：利用靶基因預測軟件分析得到miR-34b-5p作用的靶基因。構建野生型靶基因3'-UTR和變型靶基因3'-UTR熒光素酶報告基因載體，將這兩個載體分別與miR-34b-5p mimics或

9、miR-34b-5p陰性載體(miR-34b-5p m NC)共同轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細胞，雙熒光素酶報告基因分析檢測熒光素酶活性變化以證實該靶基因是否為miR-34b-5p作用的靶基因。
　　結果：(1)軟件預測Bcl-2基因為miR-34b-5p作用的靶基因。(2)與轉(zhuǎn)染miR-34b-5pmNC相比，共轉(zhuǎn)染miR-34b-5p mimics和野生型Bcl-23'-UTR的熒光素酶活性顯著下降，而轉(zhuǎn)染突變型Bcl-23'-UTR的

10、熒光素酶活性則無明顯變化，證實Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。
　　結論：成功構建了野生型和突變型Bcl-23'-UTR熒光素酶報告基因載體;軟件預測并經(jīng)熒光素酶報告基因檢測證實Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。
　　第四部分 MicroRNA-34b-5p對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響及其機制
　　目的：研究miR-34b-5p對驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響，闡明mi

11、R-34b-5p調(diào)控驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的可能機制。
　　方法：(1)原代分離培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞，以海人酸干預誘導細胞驚厥。應用TUNEL染色檢測不同濃度海人酸對海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡的影響，確定后續(xù)實驗海人酸處理用濃度。并以實時定量PCR檢測海人酸干預后海馬星形膠質(zhì)細胞miR-34b-5p表達水平的改變，Western Blot檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平的改變。(2)利用脂質(zhì)體將

12、miR-34b-5p模擬物(miR-34b-5pmimics)、miR-34b-5p抑制劑（miR-34b-5p inhibitors）以及相對應的陰性對照（miR-34b-5p m NC、miR-34b-5p i NC）瞬時轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細胞，實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染前后miR-34b-5p的表達。并檢測海人酸誘導驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡及凋亡相關指標的變化。Bcl-2 mRNA的表達用實時定量PCR檢測;海馬星形膠質(zhì)細胞的凋亡用T

13、UNEL染色進行檢測;凋亡相關指標Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達用Western Blot檢測。(3)分別將control siRNA、Bcl-2siRNA、miR-34b-5p inhibitors以及Bcl-2 siRNA+ miR-34b-5p inhibitors轉(zhuǎn)染海馬星形膠質(zhì)細胞，并用海人酸進行干預，Western Blot檢測Bcl-2沉默后對海馬星形膠質(zhì)細胞Caspase-3蛋白表達的影響。
　　

14、結果：(1)海人酸誘導驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡顯著增加，其miR-34b-5p表達水平顯著上調(diào)而Bcl-2蛋白表達明顯受到抑制;凋亡相關基因Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達顯著升高，Bax/Bcl-2的比值顯著增加。(2)與空白對照及轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mNC的海馬星形膠質(zhì)細胞相比，轉(zhuǎn)染了miR-34b-5p mimics的海馬星形膠質(zhì)細胞中miR-34b-5p的表達顯著增加，海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡率

15、、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達顯著增加，而Bcl-2蛋白的表達顯著降低;而轉(zhuǎn)染了miR-34b-5pinhibitors的海馬星形膠質(zhì)細胞中miR-34b-5p的表達顯著降低，海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白的表達則顯著增加。(3)miR-34b-5p負性調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達

16、，但對Bcl-2 mRNA的表達無影響。(4) miR-34b-5p inhibitors顯著降低Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表達，而Bcl-2 siRNA和miR-34b-5pinhibitors共轉(zhuǎn)染后Caspase-3（19kD/17kD）活性蛋白的表達顯著高于miR-34b-5p inhibitors組，表明Bcl-2 siRNA的轉(zhuǎn)染能阻斷miR-34b-5pinhibitors導致的Caspase-3(

17、19kD/17kD)活性蛋白的降低。
　　結論：(1)海人酸誘導海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡過程中，miR-34b-5p表達顯著增加。(2)成功構建了miR-34b-5p過表達和低表達細胞模型，過表達miR-34b-5p能夠促進驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡，抑制miR-34b-5p的表達可以阻礙驚厥后海馬星形膠質(zhì)細胞凋亡。(3)miR-34b-5p通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因Bcl-2表達，從而促進Caspase-3活化，激活Caspase信