丙泊酚反復(fù)暴露對發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶影響及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:丙泊酚是臨床較常用的靜脈麻醉藥，廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外臨床麻醉誘導(dǎo)及維持，ICU鎮(zhèn)靜和門診各種影像學(xué)檢查。因其具有起效快速、蘇醒迅速、用后惡心嘔吐、躁狂譫妄等副作用較小等優(yōu)點，也被廣泛應(yīng)由于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉中。盡管其被廣泛使用，丙泊酚對于兒童的安全性及副作用的矛盾報道幾乎與其他全麻藥物一樣，均無全面詳盡的結(jié)論。有報道稱丙泊酚可激活GABA受體，從而啟動細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。因為GABA介導(dǎo)的神經(jīng)元活性是哺乳動物的腦發(fā)育的必需因素，

2、因此丙泊酚麻醉很可能干預(yù)未成熟神經(jīng)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶等功能障礙。MiRNA一類能時序調(diào)控發(fā)育進(jìn)程，長度約為20～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼蛋白的小分子RNA，其通過與靶基因mRNA互補配對來降解或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控靶基因表達(dá)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNA的表達(dá)具有高度的保守性、組織特異性和時序性，是神經(jīng)發(fā)育過程中重要的調(diào)控因子。隨著對miRNA研究的深入，人們將研究視角逐漸轉(zhuǎn)移到其與全麻藥物的關(guān)系。已有實驗表明，miR-132在

3、培育的海馬神經(jīng)元中存在較多，并且發(fā)揮著重要作用包括促進(jìn)神經(jīng)元生長，增強樹突棘長度等等。因此，本課題通過探討丙泊酚麻醉對神經(jīng)發(fā)育期大鼠的海馬神經(jīng)毒性、學(xué)習(xí)記憶能力和與miR-132的變化，進(jìn)一步提供丙泊酚麻醉對大鼠海馬影響的具體分子機(jī)制。
　　材料方法:實驗動物選用體重13±3 g的7日齡的SD大鼠378只，清潔級，雌雄不拘。將大鼠隨機(jī)分為兩組(n=189只):脂肪乳組(Control組，C組)和丙泊酚組(Propofol組，P組)

4、。P組7日齡腹腔注射丙泊酚40 mg/kg，此時記為0min，再于第120min和第240min注射等量丙泊酚，連續(xù)3次;C組等時等量腹腔注入脂肪乳注射液（C組）。于末次注射后，各組立即隨機(jī)抽取5只，用動脈血氣針從左心室采動脈血0.5 ml，進(jìn)行血氣分析。待其余大鼠自然蘇醒后，放回原籠。于21日齡斷母乳飼養(yǎng)。記末次腹腔注射(240 min)為0h。各組大鼠喂養(yǎng)至28日齡及60日齡時進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測試，即Morris水迷宮實驗。末次造模

5、待大鼠翻正反射恢復(fù)時、28 d及60 d水迷宮實驗結(jié)束時，兩組大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射，取全腦制備石蠟切片，進(jìn)行Nissl染色分析、caspase-3免疫組化分析和分別利用MAP2和Spinophilin的雙重?zé)晒馊旧治龃笫蠛ｑR樹突棘變化情況。分別于末次注射后0h，4h，8h，16h，24 h，48 h及出生后第14d，28 d及60 d，大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射，麻醉后斷頭取海馬組織。利用real-tim

6、e qRT PCR方法，監(jiān)測各時間點 miR-132和p250GAP mRNA變化情況;利用western blot探討miR-132對其靶基因p250GAP，及其下游肌動蛋白Cdc42、Rac1和RhoA的調(diào)控作用;利用Western Blot蛋白檢測分析大鼠海馬樹突棘變化情況。同時，實驗大鼠（P組和C組）喂養(yǎng)至21d，稱重后，給予0.35g/kg水合氯醛腹腔注射暴露大鼠，待暴露成功后，參照大鼠腦圖譜，立體定位海馬位置，用微量注射器在

7、穿刺點緩慢注入5μ l Ad-miR-132腺病毒載體或Ad-vector空病毒載體(n=24只)。各組大鼠喂養(yǎng)至28日齡及60日齡時進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測試，即Morris水迷宮實驗;分別于微注射后第23d、28 d及60 d，水合氯醛麻醉后斷頭取海馬組織;于第28 d及60 d水迷宮實驗結(jié)束時，兩組大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉后，取全腦制備石蠟切片。利用real-time qRT PCR方法，監(jiān)測各時間點miR-132和p

8、250GAP mRNA變化情況;利用western blot探討miR-132對其靶基因p250GAP，及其下游肌動蛋白Cdc42、Rac1和RhoA的調(diào)控作用;利用MAP2和Spinophilin的雙重?zé)晒馊旧蚖estern Blot蛋白檢測分析大鼠海馬樹突棘變化情況;進(jìn)行Nissl染色分析、caspase-3免疫組化分析。
　　結(jié)果:1.丙泊酚暴露對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響:在出生后第28 d進(jìn)行的定位航行試驗第2d至5d

9、，每天P組大鼠的逃逸潛伏期明顯多于C組(*p＜0.05)。而在生后第60 d定位航行實驗中，第1至5d，每天P組大鼠的逃逸潛伏期明顯多于C組(*p＜0.05)。在第60 d進(jìn)行的空間探索實驗中，與C相比，第28及第60日齡P組大鼠，均呈現(xiàn)出明顯的平臺象限所在時間縮短(*p＜0.05)。2.丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響:在第28 d和第60 d水迷宮實驗后，P組（P組）神經(jīng)元所占百分比明顯低于各時間段C組（C組）(*p＜

10、0.05)。而在P組中，與第28 d水迷宮實驗后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元所占比率相比，第60 d水迷宮實驗后大鼠神經(jīng)元明顯降低(＃p＜0.05)。3.丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)的影響:P組在第28 d及第60 d水迷宮實驗結(jié)束后，其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(*p＜0.05)。對于P組，第60 d水迷宮實驗結(jié)束后的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯強于其

11、在第28 d水迷宮實驗后（＃p＜0.05）。4.Real-time qRT PCR檢測丙泊酚暴露后大鼠海馬組織中各時間點miR-132的變化:從大鼠出生后第1d起至第60 d，大鼠海馬區(qū)miR-132含量整體呈遞增趨勢，并且在第7d至第14d增長迅速，此外，從第14d起，海馬區(qū)miR-132含量基本維持較高水平且不再增長。與第1d相比，第10、14、21、28、35和第60 d大鼠海馬區(qū)miR-132含量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*p

12、＜0.05)。5.Real-timeqRT PCR檢測大鼠海馬組織中各時間點miR-132的變化:在C組中，與“0h”（第7d)相比，第14d、28 d和60 d時，海馬區(qū)miR-132的水平明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*p＜0.05)。對于P組，在各個時間點與各自的C組相比，miR-132水平在第4h，8h，48 h和第14d，28 d，60 d有明顯的下降，而在第16h和第24 h呈現(xiàn)出明顯的增多（＃*＜0.05）。在P組中，與第0

13、h相比，大鼠海馬miR-132水平呈現(xiàn)明顯的波動變化(**p＜0.05)，即第4h，8h，48 h和第14d，28 d，60 d有明顯的下降，而在第16h和第24 h呈現(xiàn)出明顯的增多。6.Real-time qRT PCR檢測丙泊酚暴露后大鼠海馬組織中各時間點p250GAP mRNA表達(dá)的變化:在C組中，與“0h”(第7d)相比，第14d、28 d和60 d時，海馬區(qū)p250GAP mRNA的水平明顯下降(*p＜0.05)。在P組中，與

14、第0h相比，海馬區(qū)p250GAP mRNA的表達(dá)水平自第48 h后呈明顯增加的趨勢（＃p＜0.05）。對于P組，在各個時間點與各自的C組相比，海馬區(qū)p250GAPmRNA的表達(dá)水平在自第24 h起有所增加(**p＜0.05)。7.Western Blot檢測丙泊酚暴露后大鼠海馬組織中各時間點p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白的表達(dá)情況:在C組中，與“0h”相比，我們發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)p250GAP蛋白在第28 d呈現(xiàn)明顯的表

15、達(dá)下調(diào)(*p＜0.05)，在第28 d的Cdc42和Rac1蛋白表達(dá)卻呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)增多(*p＜0.05)。在P組，與“0h”相比，我們發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)p250GAP和RhoA蛋白在第28 d呈現(xiàn)明顯的表達(dá)上調(diào)(*p＜0.05)，而在第28 d的Cdc42和Rac1蛋白表達(dá)卻呈現(xiàn)出明顯的下降(*p＜0.05)。8.丙泊酚暴露引起大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘的改變:Spinophilin在C組中表達(dá)強而多，而在P組中表達(dá)均明顯減弱(*p＜0.0

16、5)。與第28 dP組相比，第60dP組spinophilin表達(dá)進(jìn)一步降低（＃p＜0.05）;Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙泊酚暴露后大鼠海馬組織內(nèi)MAP2和spinophilin蛋白明顯的減低(*p＜0.05)。在P組內(nèi)，與第28 d相比，第60 d大鼠海馬組織內(nèi)MAP2和spinophilin蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（＃p＜0.05）。9.Real-time qRT PCR驗證各組大鼠海馬內(nèi)微注射效果:與C組相比，P組和P+ Ad

17、-vector組，大鼠海馬內(nèi)miR-132表達(dá)降低(*p＜0.05);脂肪乳+miR-132過表達(dá)組(C+Ad-miR-132組)海馬內(nèi)miR-132表達(dá)增加(*p＜0.05)，說明過表達(dá)效果存在。與P組相比，丙泊酚+ miR-132過表達(dá)組(P+ Ad-miR-132組)海馬內(nèi)miR-132表達(dá)增多(＃p＜0.05）。10.Real-time qRT PCR檢測各組大鼠海馬微注射后其miR-132變化情況:與第28d C組相比，P組和

18、P+ Ad-vector組，第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)miR-132表達(dá)均減低(*p＜0.05)。與第28d P組相比，第28d和第60dP+Ad-miR-132組海馬內(nèi)miR-132表達(dá)增多（＃p＜0.05）。11.Real-time qRT PCR檢測各組大鼠海馬微注射后其p250GAP mRNA變化情況:與C組相比，P組和P+ Ad-vector組，第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)p250GAP mRNA表達(dá)均增加(p＜0.05)。

19、與第28d P組相比，第28d和第60d P+Ad-miR-132組海馬內(nèi)p250GAP mRNA表達(dá)降低（＃p＜0.05）。12.Western Blot檢測海馬內(nèi)微注射后各組大鼠海馬內(nèi)p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白的表達(dá)情況:與第28d C組相比，在P組和P+ Ad-vector組中，第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)p250GAP和RhoA蛋白表達(dá)量均增加(*p＜0.05);而第28d和第60d大鼠海馬內(nèi)Cdc42和

20、Rac1蛋白表達(dá)量均降低(*p＜0.05)。13.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露對大鼠海馬CA1區(qū)樹突棘的影響:在第28 d時，與C組相比，P組和P+Ad-vector組中表達(dá)均明顯減弱(*p＜0.05);在第60 d時，與C組相比，P組和P+Ad-vector組中表達(dá)仍明顯減弱(＃p＜0.05);Western Blot結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，丙泊酚暴露大鼠后導(dǎo)致了其在第28 d和第60 d與C組相比，海馬組織內(nèi)MAP2和spinophilin蛋白明顯

21、的減低(*p＜0.05，＃p＜0.05)，P+ Ad-vector組表達(dá)也明顯減低(*p＜0.05，＃p＜0.05)。然而在P+Ad-miR-132組中，與第28dP組相比，MAP2和spinophilin在大鼠海馬區(qū)的蛋白含量均明顯增強(**p＜0.05);同樣，第60 d時與P組相比，其表達(dá)也明顯加強（＃＃p＜0.05）。14.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響:在出生后第28 d進(jìn)行的定位航行試驗第2d至5d，每

22、天P組和P+ Ad-vector組大鼠的逃逸潛伏期明顯長于C組(*p＜0.05;＃p＜0.05)。而第28d P+ Ad-miR-132組大鼠的逃逸潛伏期與P組相比，明顯改善(**p＜0.05)。在生后第60 d定位航行實驗第1至5d，每天P組和P+ Ad-vector組大鼠的逃逸潛伏期均明顯多于C組(*p＜0.05;＃p＜0.05);而P+Ad-miR-132組大鼠的逃逸潛伏期與P組相比明顯縮短(**p＜0.05)。在第6d進(jìn)行的空間

23、探索實驗中，與C組相比，第28及第60日齡P組和P+ Ad-vector組大鼠，均呈現(xiàn)出明顯的平臺象限所在時間縮短(*p＜0.05)。而P+Ad-miR-132組大鼠的平臺象限所在時間與P組相比明顯延長（＃p＜0.05）。15.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響:與28d C組相比，第28d P組、P+Ad-vector組和P+Ad-miR-132組，其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的比率明顯降低(*p＜0.05);在第6

24、0d時，與C組相比，P組、P+ Ad-vector組和P+Ad-miR-132組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的比率明顯下降（＃p＜0.05）。16.海馬內(nèi)微注射及丙泊酚暴露后對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)的影響:與28d C組相比，第28d P組、P+Ad-vector組和P+Ad-miR-132組，其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(*p＜0.05)。在第60d時，與C組相比，P組、P+ Ad-vec

25、tor組和P+Ad-miR-132組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多（＃p＜0.05）。
　　結(jié)論:1.新生7日齡大鼠連續(xù)接受3次40mg/kg腹腔注射丙泊酚后其近遠(yuǎn)期空間學(xué)習(xí)記憶能力有所改變，具體體現(xiàn)在:空間學(xué)習(xí)的過程呈現(xiàn)出減慢的趨勢及一定的記憶能力的損害。2、新生大鼠接受丙泊酚暴露后可導(dǎo)致其海馬神經(jīng)元樹突棘數(shù)目的改變，主要通過降低海馬miR-132含量，進(jìn)而增強靶基因p250GAP的水解能力，從而減少