異丙酚對發(fā)育期小鼠大腦海馬齒回及周邊皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)干細胞的影響.pdf

1、背景與目的:
　　我國是一個人口大國，每年都有許多的兒童接受全麻手術(shù)和治療。麻醉藥物是否會對發(fā)育期兒童的智力產(chǎn)生影響？會不會導(dǎo)致以后的學(xué)習(xí)功能障礙？這一直是眾多家長關(guān)心的一個問題，也是麻醉這一領(lǐng)域一直爭議激烈的問題。認知與學(xué)習(xí)是人類非常復(fù)雜的能力，受多種因素的影響;麻醉藥物多種多樣，發(fā)揮作用的機制也各不相同。因此到目前為止，雖然有一些臨床試驗認為:麻醉藥物對兒童的認知功能存在影響，但其數(shù)據(jù)的準確性仍然受到很大的質(zhì)疑。近幾年，相關(guān)的

2、動物實驗發(fā)現(xiàn):暴露于臨床常用的麻醉藥物可以導(dǎo)致發(fā)育期動物大腦神經(jīng)細胞的發(fā)育異常從而引起遠期的認知功能障礙和學(xué)習(xí)能力的下降。
　　在我國目前臨床上最常用于小兒的全麻藥物是異丙酚。異丙酚由于誘導(dǎo)快速，作用時間短，恢復(fù)快等優(yōu)點備受麻醉醫(yī)生的喜愛，常用于小兒短小手術(shù)的麻醉及有創(chuàng)檢查。以往的動物實驗認為:麻醉藥物是通過抑制N-甲基-D-天門冬氨酸受體(NMDA)或者激活γ-氨基丁酸受體(GABA)產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用。異丙酚也是GABA受體的

3、激動劑，是否會有相應(yīng)的神經(jīng)毒性，目前國際上研究較少。臨床上關(guān)于異丙酚導(dǎo)致遠期學(xué)習(xí)障礙的研究因其產(chǎn)生機制不明，也備受爭議。
　　眾所周知，大腦是人類的重要功能器官，是脊髓動物高級神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，是控制運動，產(chǎn)生感覺實現(xiàn)高級功能的神經(jīng)中樞。其中，海馬被認為與認知、學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)也是神經(jīng)細胞增殖的重要區(qū)域。而皮質(zhì)主要由錐體細胞構(gòu)成，由豐富的錐體細胞構(gòu)成的各種神經(jīng)環(huán)路來實現(xiàn)信息的傳導(dǎo)功能。發(fā)育期海馬齒回神經(jīng)干細胞的分化異常以及皮質(zhì)區(qū)成

4、熟錐體細胞的減少和樹突發(fā)育的異常，有可能對遠期的認知和學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生重要影響。因此，我們研究異丙酚對發(fā)育期小鼠大腦海馬神經(jīng)干細胞及皮質(zhì)錐體神經(jīng)細胞的影響，尋求調(diào)控大腦認知學(xué)習(xí)功能的機制。
　　近年的研究表明，全麻藥物引起的認知功能障礙與暴露于麻醉藥物的時期、時間長短、劑量等有相關(guān)性。出生后2周暴露于麻醉藥物就可以引起相關(guān)的神經(jīng)干細胞出現(xiàn)凋亡。P7是嚙齒類動物大腦神經(jīng)細胞發(fā)育的高峰時期，這一時期暴露與麻醉藥物也出現(xiàn)相應(yīng)的凋亡高峰。

5、最近的研究發(fā)現(xiàn):異丙酚可以影響成年動物大腦海馬區(qū)新生神經(jīng)元的存活，干預(yù)神經(jīng)細胞的成熟;它可以顯著地減少三月齡小鼠大腦海馬齒回神經(jīng)干細胞分化為成熟的神經(jīng)細胞，轉(zhuǎn)為星形膠質(zhì)細胞。這一改變可能進而影響到成熟的神經(jīng)元整合進入神經(jīng)環(huán)路的過程，導(dǎo)致了信息在神經(jīng)細胞間的傳遞障礙。有研究表明:破壞海馬體及周圍的皮質(zhì)部分會造成失憶。對于發(fā)育期的動物，異丙酚是否也通過干預(yù)海馬和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖及分化，導(dǎo)致臨時的信息傳導(dǎo)障礙以及神經(jīng)環(huán)路的形成而引起遠期

6、的學(xué)習(xí)功能障礙？
　　方法:
　　研究實驗對象選擇:C57小鼠P7，連續(xù)3天，每天1次腹腔注射Prop30mg/kg、Prop60mg/kg、同體積脂肪乳劑構(gòu)建模型。免疫組化檢測:海馬區(qū):DCX與Brdu雙標觀察異丙酚對神經(jīng)干細胞的增殖以及增殖的干細胞轉(zhuǎn)化為成熟神經(jīng)元的情況、NeuN染色觀察海馬區(qū)成熟神經(jīng)元數(shù)量的變化、高爾基染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元樹突棘形態(tài)變化。皮質(zhì)區(qū):MAP2B蛋白標記觀察皮質(zhì)錐體細胞的樹突棘密度、高爾基染色

7、觀察皮質(zhì)錐體細胞樹突棘形態(tài)、NeuN觀察皮質(zhì)區(qū)成熟神經(jīng)元數(shù)量、GFAP觀察皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量變化。
　　結(jié)果:
　　1.運用標記細胞增殖的特異性抗原標記物Brdu與標記成熟神經(jīng)元的DCX觀察異丙酚注射后對海馬齒回新增神經(jīng)干細胞增值的影響及增值的神經(jīng)干細胞分化為成熟神經(jīng)元的情況。熒光雙標顯示:與對照組比較，30mg組Brdu數(shù)量減少無統(tǒng)計學(xué)意義，60mg組Brdu數(shù)量顯著減少;30mg組Brdu+DCX數(shù)量減少無統(tǒng)計學(xué)意

8、義，60mg組Brdu+DCX數(shù)量顯著減少。藥物的劑量組間統(tǒng)計比較存在差異，以60mg組差異最為顯著。
　　2.運用成熟神經(jīng)元標記物NeuN觀察不同劑量異丙酚注射后海馬齒回成熟神經(jīng)元數(shù)量。熒光標記顯示:相同部位海馬齒回同等面積下的NeuN數(shù)量30mg組與對照組相比減少不明顯;60mg組與對照組相比細胞數(shù)量有減少但無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.運用高爾基染色顯示海馬齒回顆粒神經(jīng)元樹突棘形態(tài):在蔡司顯微鏡X100光鏡下統(tǒng)計相同長度的顆

9、粒細胞樹突棘總數(shù)，30mg組與對照組相比樹突棘總數(shù)有顯著減少;60mg組與對照組相比樹突棘總數(shù)顯著減少。成熟蘑菇狀棘突30mg組與60mg組同對照組相比顯著減少;瘦長形棘突30mg組與60mg組同對照組比較明顯增多;丁圖狀棘突對照組，30mg組，60mg組3組比較無顯著差異。
　　4.采用免疫熒光GFAP標記大腦皮質(zhì)中星形膠質(zhì)細胞數(shù)量:30mg組與對照組相比單位面積上GFAP標記的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量無顯著差異;60mg組與對照組相比

10、單位面積上GFAP標記的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量無顯著差異。
　　5.免疫熒光NeuN標記大腦皮質(zhì)中成熟神經(jīng)元數(shù)量:30mg組與對照組相比單位面積上NeuN標記的神經(jīng)元數(shù)量無顯著差異;60mg組與對照組相比單位面積上NeuN標記的神經(jīng)元數(shù)量無顯著差異。
　　6.MAP2B微觀相關(guān)蛋白標記大腦皮質(zhì)錐體細胞樹突。采用光密度分析統(tǒng)計MAP2B的組間表達差異:與對照組相比，30mg組光密度分析MAP2B表達無顯著差異;60mg組光密度分析M

11、AP2B表達明顯下降。
　　7.高爾基染色顯示小鼠大腦皮質(zhì)錐體細胞樹突棘形態(tài):30mg組與對照組相比樹突棘總數(shù)減少無顯著差異，成熟蘑菇樣形態(tài)的樹突棘與對照組相比有顯著減少;60mg組與對照組相比，樹突棘總數(shù)有顯著減少，成熟蘑菇樣形態(tài)的樹突棘也顯著減少。
　　結(jié)論:
　　1.異丙酚抑制發(fā)育期小鼠海馬齒回神經(jīng)干細胞的分化與用藥劑量有相關(guān)性。
　　2.異丙酚抑制成熟神經(jīng)元的分化數(shù)量，增加其凋亡與劑量呈相關(guān)性。