NOX1對A549細胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　肺癌是目前中國死亡率最高的癌癥。抽煙、環(huán)境污染的加劇等均是加大患肺癌風險的危險因素。而活性氧（reactive oxygen species, ROS）在上述條件下表達量均上升。NADPH氧化酶NOX（non-phagocyticcelloxidase, NOX）是非吞噬細胞中產(chǎn)生ROS的主要來源，生理情況下其產(chǎn)生的活性氧作為第二信使傳遞細胞內的各種信號通路，但在外界各種因素如腫瘤壞死因子(Tumor necrosis

2、 factor, TNF-α)、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）等的刺激下表達量升高，產(chǎn)生大量活性氧，對細胞和機體造成一系列的影響。目前有研究表明NOX1在許多腫瘤細胞系中表達量相對升高，這其中包括非小細胞肺癌。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）又稱為應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase, SAPK）,當受到外界的刺激后，J

3、NK被磷酸化激活從而參與細胞凋亡信號通路。研究證實，NOX1產(chǎn)生的ROS能夠調節(jié)JNK的活化水平。因此研究NOX1在肺腺癌A549細胞增值與凋亡中發(fā)揮的作用顯得尤為重要。
　　實驗首先通過瞬時轉染技術轉染特異性的 NOX1小干擾 RNA（ Small interference RNA，siRNA）抑制A549細胞中NOX1的表達，觀察細胞ROS水平的改變及增殖活性和凋亡率的變化，再采用TNF-α刺激A549細胞，檢測不同組別細胞凋

4、亡率的改變，以及NOX1、p-JNK和相應的ROS的表達量的改變。通過上述實驗來研究 NOX1在 A549細胞增殖與凋亡中發(fā)揮的作用，從而為NOX1在肺癌中的的作用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1實驗方法
　　1.1分別設置Mock組、NC組和NOX1siRNA組，觀察抑制NOX1表達對A549細胞增殖和凋亡的影響。采用實時熒光定量 PCR檢測不同組別NOX1mRNA的表達量。為檢測TNF-α刺激A549細胞后NOX

5、1表達量的改變，設置空白對照組、TNF-α組和TNF-α+NOX1siRNA組。
　　1.2細胞增殖活性檢測：轉染12 h后對Mock組、NC組和實驗組進行MTT實驗，自轉染后12 h開始直至48 h之內，每隔12h分別檢測不同組別在492nm處的光密度值。
　　1.3細胞活性氧的測定：轉染24h后對不同組別采用DCFH-DA標記后用流式細胞儀檢測其熒光值。
　　1.4細胞相應蛋白表達量的檢測：轉染NOX1siRNA至

6、細胞48 h以后，提取不同組別細胞的蛋白進行Western blot實驗，內參蛋白為β-actin，所得結果采用Quantity One軟件分析不同組別蛋白相對表達量。
　　1.5細胞凋亡率的檢測：抑制NOX1表達的48 h后，消化不同組別的細胞并吹打混勻成單細胞懸液， Annexin-V-FITC、PI雙染法處理細胞懸液，流式細胞儀上機檢測不同組比細胞的凋亡率。
　　2統(tǒng)計方法：采用SPSS21.0對不同組別數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學

7、分析，采用單因素方差分析比較三組的均數(shù)之間的差異，兩兩比較采用LSD法或Dunnett法。檢驗水準取α=0.05。
　　結果:
　　1.轉染 NOX1siRNA對NOX1在A549細中表達的干擾效果：NOX1mRNA表達量與Mock組相比下降了約78％；NOX1蛋白的表達量與Mock組相比下降了約70%。
　　2.抑制 NOX1表達對 A549細胞增殖活性的影響：與 Mock組相比較， NOX1siRNA組細胞在24

8、h、36 h和48 h的增殖活性均下降（P＜0.05）。
　　3.ROS表達量的改變：與Mock組相比，NOX1siRNA組的ROS水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與空白對照組相比較，TNF-α組的 ROS水平升高；與TNF-α組相比，TNF-α組+NOX1siRNA組的ROS水平下降；與空白對照組相比，TNF-α組+siRNA組的ROS水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.Western bl

9、ot：NOX1組的p-JNK表達量與Mock組和NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組相比，TNF-α組的NOX1與p-JNK表達量均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與TNF-α相比，TNF-α組+NOX1siRNA組的NOX1與p-JNK表達量均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5.抑制NOX1表達對A549細胞凋亡率的影響：NOX1siRNA組細胞早期凋亡率與NC組和Mock組相比差異無統(tǒng)計學