X射線聯(lián)合Pokemon-siRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖影響研究.pdf

1、目的:
　　 研究X射線不同劑量及照射后不同時(shí)間對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞Pokemon基因及其蛋白表達(dá)的影響；設(shè)計(jì)構(gòu)建抑制Pokemon表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)慢病毒載體,流式篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,探討siRNA對(duì)Pokemon表達(dá)的作用及聯(lián)合X射線對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響,為探索放療聯(lián)合生物治療惡性腫瘤的新模式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 體外培養(yǎng)A549細(xì)胞,構(gòu)建Pokemon-siRNA

2、慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,流式細(xì)胞儀篩選穩(wěn)定株；X射線照射各組細(xì)胞,以熒光實(shí)時(shí)定量PCR法和Western-blotting法分別檢測(cè)Pokemon基因及蛋白表達(dá)水平,四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況。
　　 結(jié)果:
　　 1、X射線照射對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞Pokemon基因表達(dá)的影響
　　 用吸收劑量分別為2、4、6和8 Gy的X射線照射體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞,2、4、8、12、24

3、、48和72 h后用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其中的PokemonmRNA表達(dá)水平,和對(duì)照組相比,在照射后的早期(除2 Gy照射后的2和4 h外)Pokemon mRNA的表達(dá)降低,但在晚期(48 h以后)呈升高趨勢(shì),在大部分時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.4　　 2

4、、X射線照射對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞Pokemon蛋白表達(dá)的影響
　　 用吸收劑量分別為2、4、6和8 Gy的X射線照射體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549細(xì)胞,2、4、8、12、24、48和72 h后用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)其中的Pokemon蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示Pokemon蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均升高,且各劑量組均在照射后8 h達(dá)峰值,在大部分時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.18

5、),其中6 Gy照射后8 h,A549細(xì)胞Pokcmon蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高峰(3.35±0.02,P<0.05)。
　　 3.X射線聯(lián)合Pokemon-siRNA對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)
　　 用基因測(cè)序的方法鑒定了設(shè)計(jì)的4對(duì)Pokemon-siRNA中Pokemon-siRNA1和Pokemon-siRNA4完全正確地克隆入干涉載體PsicoR,并成功包裝了這兩對(duì)siRNA的慢病毒載體系統(tǒng),轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,

6、以流式分選技術(shù)篩選出轉(zhuǎn)染效率較高(接近100％)的穩(wěn)定株。其中,轉(zhuǎn)染Pokemon-siRNA1的細(xì)胞Pokemon mRNA和蛋白分別降低了76％和66％,而Pokemon-siRNA4的干擾效率只有27％。Pokcmon-siRNA聯(lián)合照射組與單純照射組相比,A549細(xì)胞Pokemon mRNA表達(dá)顯著降低(0.34±0.14 VS3.51±1.42,P<0.05)。同時(shí),MTT數(shù)據(jù)顯示Pokemon-siRNA聯(lián)合照射組的增殖能力

7、從第2～5 d均顯著低于對(duì)照組、單純照射組(除第3 d外)和單純轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、一定劑量的X射線可增加A549細(xì)胞Pokemon基因和蛋白的表達(dá)。
　　 2、Pokemon-siRNA可有效抑制A549細(xì)胞Pokemon表達(dá),并能抑制A549細(xì)胞的增殖能力。
　　 3、X射線聯(lián)合應(yīng)用Pokemon-siRNA可顯著抑制A549細(xì)胞的體外增殖能力,提示照射后Pokemon表