黑素瘤MAGe-A1基因以及EMT相關miRNA功能研究.pdf

1、MAGE-A1基因(Melanoma Associated Antigen Family A1)是一種癌癥生殖(cancer-germline，CG)基因或者腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)基因，染色質(zhì)定位于人類X染色體q28區(qū)域，近年來發(fā)現(xiàn)MAGE-A1基因在多種腫瘤中，包括黑素瘤中表達增高。本研究通過之前研究發(fā)現(xiàn)，從色素痣、原位黑素瘤到轉(zhuǎn)移黑素瘤MAGE-A1基因表達逐步增高。
　　miRNA

2、是存在真核生物體內(nèi)的內(nèi)源性小分子RNA，長度約22bp左右，miRNA通過與靶基因結(jié)合形成二聚體，可導致靶基因的降解或者抑制其翻譯，達到調(diào)節(jié)基因表達的目的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在黑素瘤EMT過程中，多個重要調(diào)節(jié)基因可以被多個miRNA調(diào)控。本研究結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄組和miRNA組數(shù)據(jù)，分析對黑素瘤EMT過程有重要調(diào)控作用的miRNA。
　　目的：
　　1.確定MAGE-A1基因在黑素瘤惡化和轉(zhuǎn)移過程中的作用，研究其分子調(diào)控機制。<

3、br>　　2.篩選出對黑素瘤EMT過程有重要調(diào)控作用的miRNA，驗證其細胞生物學功能和參與的調(diào)控網(wǎng)絡。
　　方法：
　　一、MAGE-A1基因過表達及敲低對黑素瘤細胞功能的影響及其作用機制分析
　　1.qRT-PCR檢測細胞系及黑素瘤患者樣本中MAGE-A1基因的表達。2.在A375，A2058細胞構(gòu)建過表達和敲低MAGE-A1基因細胞系。3.應用克隆形成，細胞增殖和細胞周期實驗觀察過表達和敲低MAGE-A1基因?qū)?/p>

4、素瘤細胞增殖能力的影響。4.Transwell小室實驗觀察過表達和敲低MAGE-A1基因?qū)谒亓黾毎忠u和遷移能力的影響。5.通過RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序研究A375細胞中過表達和敲低MAGE-A1基因?qū)毎虮磉_的影響，運用GO和IPA等生物信息學軟件分析其影響的細胞功能并構(gòu)建相應的調(diào)控網(wǎng)絡。
　　二、miRNA調(diào)控黑素瘤EMT過程的分子網(wǎng)絡及其調(diào)控機制
　　1.結(jié)合mRNA轉(zhuǎn)錄組和miRNA組數(shù)據(jù)，應用生物信息學方法篩

5、選對黑素瘤EMT過程有調(diào)控作用的miRNA。2.qRT-PCR檢測細胞系中miRNA的真實表達情況。3.通過transwell小室實驗觀察A375細胞過表達miRNA對黑素瘤遷移能力的影響。4.運用IPA等軟件分析在黑素瘤EMT過程中miRNA靶基因參與的細胞功能和調(diào)控網(wǎng)絡。5.qRT-PCR分析過表達miRNA細胞系中EMT相關關鍵基因的表達變化。
　　結(jié)果：
　　一、MAGE-A1基因過表達及敲低對黑素瘤細胞功能的影響及

6、其作用機制分析
　　1.相比色素痣，黑素瘤細胞系和患者組織樣本中MAGE-A1基因的表達水平升高，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。2.在黑素瘤A375和A2058細胞系，過表達MAGE-A1基因能明顯增強黑素瘤的克隆形成和細胞增值能力，反之敲低MAGE-A1基因?qū)е孪陆?，細胞周期測定與上述結(jié)果一致(P＜0.05)。3.黑素瘤中過表達MAGE-A1基因，其侵襲和遷移能力增強，而敲低則導致降低(P＜0.05)。4.RNA-s

7、eq分析發(fā)現(xiàn)，MAGE-A1基因通過對MAPK-ERK，PI3K-AKT，NF-κB，Hedgehog和Wnt信號通路的調(diào)控影響黑素瘤的EMT過程。
　　二、miRNA調(diào)控黑素瘤EMT過程的分子網(wǎng)絡及其調(diào)控機制
　　1.通過Mirbase等軟件預測出11個miRNA和48個對應的靶基因。2.在3個細胞系中，經(jīng)過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)7個miRNA與預測的結(jié)果一致。3.黑素瘤細胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)除miR-195-5p外，其它6個m

8、iRNA過表達對黑素瘤的遷移能力有明顯的影響。4.在7個過表達miRNA細胞系，對EMT相關重要基因進行mRNA水平驗證發(fā)現(xiàn)mir-195-5p，mir-130a-3p，mir-509-5p和mir-509-3-5p這4個miRNA對黑素瘤EMT過程具有重要影響。5.通過11個miRNA對應的48個靶基因構(gòu)建分子調(diào)節(jié)通路發(fā)現(xiàn)，11個miRNA參與了多個腫瘤EMT相關的通路調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　1 MAGE-A1基因通過MA

9、PK-ERK、PI3K-AKT、NF-κB、Hedgehog和Wnt等多個信號通路參與黑素瘤的EMT過程，并對黑素瘤細胞的克隆形成，細胞增殖和侵襲遷移能力產(chǎn)生影響。
　　2.生物信息學研究發(fā)現(xiàn)11個miRNA通過干預Wnt、VEGF、NF-κB、PTEN、PI3K-AKT等信號通路途徑;以及對TP53、c-MYC和MMP9等重要基因的促進或者抑制作用，調(diào)控黑素瘤的EMT過程。通過體外transwell小室等生物學實驗證實，其中6個