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文檔簡介
1、研究背景與目的:
胃癌(Gastric cancer)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴重影響人類健康。MicroRNA(miRNA)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA,研究發(fā)現,miRNA調節(jié)著人類約三分之二的基因,miRNA在細胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用,越來越多引起研究人員的關注。隨著對于miRNA作用研究的進一步深入,人們發(fā)現miRNA基因調控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,包括胃癌等一系列
2、癌癥。在本論文中,針對胃癌高發(fā)區(qū)人群,首先通過胃癌組織與癌旁組織的芯片表達譜研究,篩選胃癌相關miRNA,并進一步在高發(fā)區(qū)人群中應用qRT-PCR對差異表達的miRNA進行表達分析,同時展開臨床資料相關性分析,在此研究基礎上進一步研究胃癌相關miRNA對細胞生物學功能的影響。研究為明確miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及為胃癌的診斷和治療提供潛在生物標志物。
研究方法與結果:
1.胃癌相關miRNA的篩選
本
3、研究收集胃癌高發(fā)區(qū)甘肅省武威市胃癌患者的癌組織及癌旁組織,患者均為經病理診斷明確的胃癌新發(fā)病例,未經放化療治療,共10對,同時收集患者臨床相關資料。使用Trizol裂解液提取組織總RNA,通過OD260/280值檢測來判斷RNA的純度,結果顯示,OD260/280值均在1.8-2.0之間,組織總RNA純度較好。采用高通量芯片對10對胃癌患者的癌組織和癌旁組織進行miRNA/mRNA表達譜檢測,篩選出具有差異表達的61個miRNA,其中3
4、8個上調miRNA和23個下調miRNA。應用DIANA-mirPath V.3軟件對miRNA和mRNA進行GO功能注釋和KEGG通路分析,并構建miRNA-mRNA共表達網絡,分析胃癌差異化表達的miRNA的潛在功能。KEGG結果表明胃癌相關差異表達miRNA主要參與ErbB、PI3K-Akt、細胞周期、細胞凋亡等癌癥相關信號通路。
2.人群胃癌相關差異表達miRNA相關性分析
收集胃癌高發(fā)區(qū)患者癌組織及癌旁組織
5、共82對,通過qRT-PCR方法,對上述芯片結果中隨機挑選的3個具有差異性表達的miRNA進行定量檢測,應用配對T檢驗進行統(tǒng)計分析,結果顯示與癌旁組織相比,miR-9-5p在胃癌組織表達明顯上調(p<0.05),miR-3123和miR-133a-3p在胃癌組織表達明顯下調(p<0.05),與芯片結果一致。對miRNA分別在胃癌早期、中晚期表達進行分析,結果顯示miR-9-5p和miR-3123在胃癌早期出現明顯表達水平的改變,miR-
6、133a-3p表達水平的差異在胃癌早期和中晚期呈現遞增,提示miR-9-5p和miR-3123可作為胃癌早期診斷的潛在生物標志,miR-133a-3p可作為胃癌進展相關的潛在生物標志。進一步進行獨立樣本T檢驗,對胃癌相關差異性表達miRNA和胃癌患者臨床資料進行相關分析,包括性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、是否淋巴轉移、TNM分期等。結果顯示miR-133a-3p下調與淋巴結轉移顯著相關(p<0.05)。
3.胃癌相關差異表達
7、miRNA生物學功能研究
對人正常胃黏膜上皮細胞GES-1和不同胃癌細胞MKN-45、MGC-803進行qRT-PCR檢測,發(fā)現與人正常胃粘膜上皮細胞相比,miR-9-5p在胃癌細胞中顯著高表達,與芯片和人群研究結果一致。以GES-1為研究對象,對其進行miR-9-5p mimics轉染,上調GES-1細胞中miR-9-5p的表達水平,應用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細胞儀檢測miR-9-5p表達改變對細胞增殖、細胞凋亡、
8、細胞周期等細胞生物學功能的影響。結果顯示,miR-9-5p上調后,GES-1細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期無顯著性改變(p>0.05),未發(fā)現單一miR-9-5p表達改變對胃粘膜上皮細胞生物學功能有影響。單個miRNA對細胞功能的影響可能較弱,今后需進一步探討多個miRNA表達改變對細胞功能的影響。
研究結論:
本研究通過miRNA/mRNA芯片表達譜分析,在胃癌組織中篩選出61個差異表達miRNA。KEGG結果表明胃
9、癌相關差異表達miRNA主要參與ErbB、PI3K-Akt、細胞周期、細胞凋亡等癌癥相關信號通路。胃癌高發(fā)區(qū)人群檢測發(fā)現,miR-9-5p在胃癌組織中高表達,miR-3123和miR-133a-5p在胃癌組織中低表達。進一步分析發(fā)現,miR-9-5p和miR-3123在胃癌早期即出現明顯表達改變,提示其可作為胃癌早期診斷潛在生物標志;miR-133a-3p表達改變在胃癌早期和中晚期呈現遞增,且與淋巴轉移顯著相關,提示其可作為胃癌進展相關
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