無創(chuàng)性延遲肢體缺血預適應對抗大鼠腦缺血再灌注損傷的線粒體相關機制研究.pdf

1、【目的】
　　本研究利用大鼠腦缺血再灌注（I/R）模型和無創(chuàng)性延遲肢體缺血預適應（NDLIP）模型，探索線粒體 ATP敏感性鉀通道（mitoKATP）和線粒體滲透性轉換孔（mPTP）在NDLIP對抗大鼠腦I/R損傷中的作用，觀察NDLIP在腦I/R損傷后對缺血區(qū)皮層線粒體膜電位及氧化呼吸鏈酶復合體活性的影響，探討NDLIP對抗腦I/R損傷的線粒體相關機制。
　　【方法】
　　健康的雄性Wistar大鼠隨機分成9組。（1

2、）Sham組：取頸正中切口，分離頸部肌肉組織，暴露左側頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，游離左側頸總動脈，但不夾閉。（2）I/R組：建立大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型，實施缺血1h/再灌注24h。（3）NDLIP組：每天實施左后肢缺血5min/再灌注5min，循環(huán)3次，連續(xù)3天，第4天建立MCAO模型，腦缺血1h/再灌注24h。（4） DIA組：尾靜脈注射 mitoKATP開放劑二氮嗪（Diazoxide，DIA）5mg/kg（溶解于0

3、.1M NaOH溶液，注射劑量為0.6ml），30 min后建立MCAO模型，腦缺血1h/再灌注24h。（5）NDLIP+5-HD組：左后肢實施3次5min缺血/5min再灌注，每天1次，連續(xù)3天，第4天尾靜脈注射 mitoKATP抑制劑5-羥基喹酸鹽（5-Hydroxydecanoate sodium，5-HD）10mg/kg（溶解于0.9％生理鹽水，注射劑量為0.6ml），30 min后建立MCAO模型，對腦實施1h缺血/24h再灌

4、注。（6）NaOH組：尾靜脈注射0.1M NaOH溶液0.6ml，30 min后建立MCAO模型，對腦實施1h缺血/24h再灌注。（7）NDLIP+Atr組：左后肢實施3次5min缺血/5min再灌注，每天1次，連續(xù)3天，第4天側腦室注射mPTP開放劑蒼術苷（atractyloside，Atr）10ul（3mM，溶解于0.9%生理鹽水），30 min后建立MCAO模型，對腦實施1h缺血/24h再灌注。（8） CsA組：側腦室注射 mPT

5、P抑制劑環(huán)孢素 A（Cyclosporin A， CsA）10ul（3uM，溶解于0.9%生理鹽水），30 min后建立MCAO模型，對腦實施1h缺血/24h再灌注。（9）NS組：側腦室注射0.9%生理鹽水（normal saline， NS）10ul，30 min后建立MCAO模型，對腦實施1h缺血/24h再灌注。大鼠實施1h缺血/24h再灌注后進行行為評分觀察神經(jīng)功能變化，TTC染色法測定腦梗死面積，Western Blot法檢測皮

6、層Bax、Bcl-2和Caspase3蛋白含量，提取缺血區(qū)皮層腦組織線粒體，JC-1探針檢測線粒體膜電位，比色法測定線粒體氧化呼吸連酶復合體I、II和IV的活性。
　　【結果】
　　1、大鼠左側大腦中動脈缺血1h再灌注24h后，與I/R組（2.2±0.7）相比， NDLIP組（1.0±0）、DIA組（1.0±0）和CsA組（1.0±0）大鼠的行為評分明顯降低（p<0.01）；與 NDLIP組比較，NDLIP+5-HD組（1.

7、8±0.7）、NaOH組（2.2±0.7）、NDLIP+Atr組（2.0±1.0）和NS組（2.3±0.7）大鼠的行為評分顯著升高（p<0.01）。
　　2、大鼠左側大腦中動脈缺血1h再灌注24h后，Sham組未見梗死區(qū)域，與I/R組（17.94%）相比，NDLIP組（10.88%）、DIA組（10.35%）和CsA組（9.91%）大鼠的腦組織梗死面積明顯降低（p<0.01）；與NDLIP組比較，NDLIP+5-HD組（19.18

8、%）、NaOH組（18.52%）、NDLIP+Atr組（18.24%）和NS組（19.29%）大鼠的腦組織梗死范圍顯著升高（p<0.01）。
　　3、大鼠左側大腦中動脈缺血1h再灌注24h后，與Sham組相比，受到腦I/R損傷的大鼠缺血區(qū)皮層腦組織的Bax、Caspase3表達增多，Bcl-2表達降低，具有非常顯著性差異（p<0.01）；與I/R組比較，NDLIP組、DIA組和CsA組的Bax表達顯著下降（p<0.01），Casp

9、ase3表達明顯降低（p<0.01），而Bcl-2表達則相對增高（p<0.01）；與 NDLIP組比較，NDLIP+5-HD組、NaOH組、NDLIP+Atr組和NS組的Bax表達顯著增高（p<0.01），Caspase3表達明顯增加（p<0.01），而Bcl-2表達則相對降低（p<0.01）。
　　4、大鼠左側大腦中動脈缺血1h再灌注24h后，與Sham組（171.97±5.20）相比，受到腦I/R損傷的大鼠線粒體膜電位明顯降低

10、（p<0.01），與I/R組（83.28±3.65）相比，NDLIP組（116.18±3.45）、DIA組（112.50±5.02）和CsA組（110.48±5.31）大鼠的線粒體膜電位明顯升高（p<0.01），與 NDLIP組比較， NDLIP+5-HD組（86.55±2.70）、NaOH組（81.58±2.60）、NDLIP+Atr組（80.41±9.28）和NS組（85.17±3.54）大鼠的線粒體膜電位顯著降低（p<0.01）。

11、
　　5、大鼠左側大腦中動脈缺血1h再灌注24h后，與Sham組相比，受到腦I/R損傷的大鼠缺血區(qū)皮層腦組織的線粒體呼吸鏈酶復合體I、復合體II和復合體IV活性降低（p<0.01）；與I/R組比較，NDLIP組、DIA組和CsA組的復合體I、復合體II和復合體IV活性升高（p<0.01）；與NDLIP組比較，5-HD組、NaOH組、Atr組和NS組的復合體I、復合體II和復合體IV活性降低（p<0.01）。
　　【結論】

12、r>　　1、NDLIP能夠促進mitoKATP通道的開放，抑制mPTP開放，減小腦I/R損傷后腦梗死面積，改善神經(jīng)功能障礙，起到腦保護作用。
　　2、I/R損傷后，損傷半球腦組織中的Bcl-2表達受到抑制， Bax和凋亡蛋白酶caspases3含量升高，Bcl-2/Bax降低，表明I/R損傷后，由Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)的線粒體相關的凋亡通路被激活，而NDLIP能夠明顯抑制這一凋亡信號通路，其機制可能是通過促進mitoKATP通道的