姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠肝纖維化作用.pdf

1、目的:
　　本研究首先收集不同病因?qū)е碌腃LD患者肝組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)不同病因?qū)е碌腃LD患者肝組織中單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1水平進(jìn)行分析，以明確單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1表達(dá)與CLD患者肝纖維化的關(guān)系。進(jìn)一步通過(guò)建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和肝纖維化模型，驗(yàn)證單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1在肝損傷和纖維化中的作用，并觀察姜黃素抗肝損傷和纖維化的作用，探討姜黃素抑制MCP-1減輕單核細(xì)胞來(lái)源的

2、巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗肝損傷和纖維化的作用機(jī)理，為姜黃素的應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)為肝纖維化的治療提供新的思路。
　　方法:
　　第一部分 慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)研究
　　收集93例CLD患者，包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者65例，原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)患者7例，自身免疫性肝炎(autoimmune he

3、patitis，AIH)患者14例，酒精性肝病(alcoholic liverdisease，ALD)患者7例及23例正常供肝組織石蠟標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CLD患者及正常對(duì)照肝組織中CD68+巨噬細(xì)胞和MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況及MCP-1表達(dá)。比較不同病因的CLD患者與正常對(duì)照組肝組織CD68+巨噬細(xì)胞和MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1表達(dá)情況的差異及其與炎癥分級(jí)和纖維化分期的關(guān)系。

4、　　第二部分 姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用
　　1.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷作用:
　　C57BL/6小鼠單次腹腔注射CCl4建立急性肝損傷模型并給予姜黃素灌胃干預(yù)，檢測(cè)各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平;進(jìn)行小鼠肝組織HE染色

5、，評(píng)價(jià)姜黃素的抗急性肝損傷作用;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞及NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及其亞群比例。并采用抗CD45抗體、抗F4/80抗體、抗CD11b抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，檢測(cè)各組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞浸潤(rùn)情況。Real time PCR檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)炎癥因子TN

6、F-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)。Real time PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肝組織MCP-1的表達(dá)。
　　2.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠肝纖維化作用:
　　C57BL/6小鼠反復(fù)腹腔注射CCl4，連續(xù)6周，建立肝纖維化模型，姜黃素灌胃給藥，檢測(cè)各組小鼠血清ALT和AST水平;小鼠肝組織HE染色、Masson染色，評(píng)價(jià)姜黃素的抗肝纖維化作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織中T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK

7、細(xì)胞及NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及其亞群比例。并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞浸潤(rùn)情況。Real time PCR檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1 mRNA表達(dá)。Real time PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肝組織MCP-1的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)α-SMA表達(dá)，探討姜黃素對(duì)HSC活化的影響。
　　結(jié)果:

8、r>　　第一部分 慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)研究
　　1.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞均較正常對(duì)照肝組織明顯增多。CLD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh評(píng)分均呈明顯的正相關(guān)，與Alb等水平無(wú)明顯的相關(guān)性。
　　2.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞均較正常對(duì)照

9、肝組織明顯增多，而不同病因CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh評(píng)分均無(wú)明顯的相關(guān)性，而與Alb呈負(fù)相關(guān)，與CRP水平呈正相關(guān)。
　　3.正常對(duì)照肝組織，僅有很少量MCP-1表達(dá)，而CLD患者肝組織內(nèi)可見大量MCP-1表達(dá)。不同纖維化分期的CLD患者，肝組織內(nèi)MCP-1評(píng)

10、分均較正常對(duì)照組明顯增高，而S4期患者M(jìn)CP-1評(píng)分又明顯高于S0-1、S2及S3期CLD患者。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MCP-1表達(dá)與CD68+巨噬細(xì)胞及MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量均呈明顯的正相關(guān)。
　　第二部分姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用
　　1.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷作用:CCl4單次注射可以顯著造成小鼠急性肝損傷，表現(xiàn)為CCl4注射48

11、h后小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高;肝組織HE染色示，CCl4注射后小鼠肝組織肝細(xì)胞大量壞死，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。姜黃素治療并不能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平，但可以明顯減輕小鼠肝細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。CCl4單次腹腔注射后，小鼠肝組織單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯增加，而增加的單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞主要為Gr1hi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。而其他細(xì)胞如T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞變化不明顯。姜黃

12、素能夠明顯抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，能抑制Gr1hi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。免疫組化分析示模型組肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增加，而姜黃素組可以明顯減少這些細(xì)胞的浸潤(rùn)。CCl4注射48 h后小鼠肝組織炎癥因子TF-α、IL-6較正常對(duì)照組明顯增高，IL-1β亦有增高的趨勢(shì)。姜黃素組小鼠肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β較模型組并無(wú)明顯降低。Real time PCR檢

13、測(cè)各組小鼠肝組織MCP-1的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高。而姜黃素組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1 mRNA水平亦明顯高于正常對(duì)照組，但較模型組無(wú)明顯降低。進(jìn)一步對(duì)小鼠肝組織采用MCP-1抗體進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)明顯較正常對(duì)照組增強(qiáng)，而姜黃素組小鼠肝組織MCP-1染色明顯弱于模型組。
　　2.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠肝纖維化作用:

14、r>　　CCl4反復(fù)注射可以顯著造成小鼠肝纖維化，表現(xiàn)為小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高;肝組織HE染色示，肝細(xì)胞大量壞死，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);Masson染色示小鼠肝組織內(nèi)膠原纖維較正常對(duì)照組明顯增多，肝小葉纖維間隔形成。姜黃素治療能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平，明顯減輕小鼠肝細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕肝組織纖維增生。CCl4反復(fù)腹腔注射后，模型組小鼠肝組織單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯增加

15、，而增加的單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞主要為Gr1hi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。模型組CD3+T細(xì)胞比例及DC細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組，而NK及NKT細(xì)胞比例明顯低于正常對(duì)照組。而姜黃素對(duì)T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞無(wú)明顯影響。但姜黃素能夠明顯抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，主要以抑制Gr1hi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞亞群為主。免疫組化分析示模型組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞較正常對(duì)照組明

16、顯增加，而姜黃素可以明顯減少這些細(xì)胞的浸潤(rùn)。CCl4注射6周后模型組小鼠TNF-α水平較正常對(duì)照組明顯增高，IL-1β、IL-6 mRNA水平亦呈增高趨勢(shì)，而姜黃素能明顯降低肝組織內(nèi)促炎因子TNF-α mRNA表達(dá)。模型組小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1mRNA水平較正常對(duì)照組明顯增高，而姜黃素干預(yù)后小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1mRNA水平較模型組明顯降低。Real time PCR及免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠肝組織MCP-1的表達(dá)水平，結(jié)果提示模型

17、組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高。而姜黃素能明顯降低小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)水平。小鼠肝組織MCP-1免疫組化也有同樣發(fā)現(xiàn)。此外，α-SMA免疫組化還表明，姜黃素能明顯抑制α-SMA表達(dá)，提示其能抑制HSC的活化。
　　結(jié)論:
　　1.不同病因的CLD患者肝組織內(nèi)巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞明顯增多且與肝臟的炎癥程度和纖維化程度相關(guān);MCP-1可能介導(dǎo)了CLD患者肝組織內(nèi)的單核細(xì)胞浸潤(rùn);