甜葉菊毛狀根培養(yǎng)體系的建立及綠原酸類化合物的積累研究.pdf

1、甜葉菊(Stevia rebaudianum Bertoni)是我國80年代初從國外引進的一種農業(yè)經濟作物，其葉片中有很高含量的二萜類物質—甜菊糖苷，甜度高、熱量低且有許多生物活性，因而引起了學者們廣泛的關注，目前已在我國廣為栽培。除甜菊糖苷外，甜葉菊葉片中還含有多酚、黃酮、三萜、生物堿、甾醇等多種活性成分，在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)有很好的應用前景，但由于含量不太高且難于在提取甜菊糖苷的同時進行分離純化，因而尚未引起人們的重視。本文基

2、于現(xiàn)代植物生物技術，利用發(fā)根農桿菌介導轉化法成功誘導出了甜葉菊毛狀根，通過PCR方法對毛狀根進行了鑒定，并利用HPLC-MS和HPLC技術鑒定了毛狀根中主要成分—綠原酸類化合物；在此基礎上，以綠原酸類化合物產量為評價指標優(yōu)化了毛狀根主要培養(yǎng)條件，建立了穩(wěn)定的甜葉菊毛狀根培養(yǎng)技術體系，為毛狀根培養(yǎng)生產綠原酸類化合物提供了理論參考。主要研究內容如下：
　　1、毛狀根的誘導和鑒定；以發(fā)根農桿菌C58C1和甜葉菊無菌葉片為研究材料，采用共

3、培養(yǎng)法誘導毛狀根。在侵染后第三周，甜葉菊葉片上有白色的不定根長出；將經過除菌后的不定根接種于無外源激素的1/2MS固體培養(yǎng)基，其生長迅速，形態(tài)上表現(xiàn)出多分枝、無向地性等明顯的毛狀根特征，初步判斷為毛狀根。進一步的基因檢測結果表明，發(fā)根農桿菌Ri質粒上的rolB和rolC基因已成功地轉導至甜葉菊基因組中，毛狀根為農桿菌侵染甜葉菊葉片所致。選取生長迅速的毛狀根，接種于1/2MS液體培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，初步建立了毛狀根液體培養(yǎng)技術體系。

4、r>　　2、毛狀根中主要次生代謝物的定性定量分析；選取1/2MS液體培養(yǎng)基中收獲的毛狀根，采用70％乙醇進行超聲輔助提取，提取物采用HPLC-MS和HPLC技術進行定性定量分析。從HPLC譜圖來看，毛狀根提取物中主要有三個液相峰；進一步的HPLC-MS檢測結果表明，其分子離子峰的質荷比分別為353、515和515，推定其分子式可能為C16H18O9和C25H24O12；經過與相關參考文獻的比對分析，初步推斷其分別為綠原酸和二咖啡酰奎寧酸

5、。在以上檢測分析的基礎，進一步進行HPLC鑒定，將其相對保留時間與標準品進行精確對比，并進行加標檢測分析，最終分別被確定為綠原酸(CGA)、3,5-二咖啡?？鼘幩?3,5-CQA)和4,5-二咖啡?？鼘幩?4,5-CQA)。在此基礎上，建立了同步測定三種化合物的HPLC分析方法，并對三種成分進行定量分析。
　　3、優(yōu)良毛狀根根系的篩選；挑選8個生長速度較快的單克隆根系進行繼代和擴培，經PCR檢測確定均為毛狀根，以產量為評價指標，篩

6、選高產綠原酸類化合物的優(yōu)良根系。經過24d培養(yǎng)，T3根系的生物量和綠原酸類化合物含量均最高，收獲的濕重和干重分別為15.23和1.54g/100mL，綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩岷?,5-二咖啡?？鼘幩岬暮糠謩e為39.41、48.10和3.51mg/g，三種綠原酸類化合物的總產量高達140.36mg/100mL，因此優(yōu)選T3根系進行后續(xù)研究。
　　4、毛狀根主要培養(yǎng)條件的優(yōu)化；以綠原酸類化合物產量為評價指標，研究了碳源種類、培

7、養(yǎng)基種類和碳源添加量對毛狀根生長和綠原酸類化合物積累的影響。結果表明，B5+40g/L蔗糖最適合綠原酸類化合物的積累，在此培養(yǎng)條件下，毛狀根收獲的濕重和干重分別為17.93和2.34mg/100mL，綠原酸、3,5-二咖啡酰奎寧酸和4,5-二咖啡?？鼘幩岬暮糠謩e為39.44、57.72和2.48mg/g，總綠原酸類化合物的產量高達233.54mg/100mL，比未優(yōu)化條件前的總產量提高了66.39%。
　　5、甜葉菊毛狀根培養(yǎng)生

8、產綠原酸類化合物體系的建立；在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，研究了毛狀根動態(tài)生長特征及綠原酸類化合物積累規(guī)律。結果表明，第10d為最佳繼代時間，第27d為最佳收獲時間；優(yōu)化條件下毛狀根中綠原酸類化合物產量高達234.40mg/100mL。
　　綜上所述，利用發(fā)根農桿菌C58C1轉化甜葉菊葉片，可獲得甜葉菊毛狀根，篩選優(yōu)良根系和優(yōu)化培養(yǎng)條件可大幅提高毛狀根中綠原酸類化合物的產量，通過甜葉菊毛狀根培養(yǎng)生產綠原酸類化合物具有很好的應用前景。本研究為毛