曼氏迭宮絳蟲半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)與鑒定及其用于裂頭蚴病血清學(xué)診斷的研究.pdf

1、裂頭蚴病(sparganosis)是由迭宮屬絳蟲的幼蟲-裂頭蚴(plerocercoid)侵入人體引起的一種嚴(yán)重的自然疫源性疾病，在我國及東南亞國家該病主要是由曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni)裂頭蚴引起的。裂頭蚴病的臨床表現(xiàn)因寄生部位而異，復(fù)雜多樣且缺乏特異性。目前裂頭蚴病的診斷主要是病原學(xué)檢查、影像學(xué)檢查和血清學(xué)檢查，但病原學(xué)診斷非常困難，活檢時(shí)很難發(fā)現(xiàn)蟲體，尤其是當(dāng)裂頭蚴在中樞神經(jīng)系統(tǒng)寄生時(shí)，手術(shù)探查的風(fēng)險(xiǎn)較大；

2、影像學(xué)檢查只能定位，不能定性。應(yīng)用裂頭蚴蟲體可溶性抗原(粗抗原)及排泄分泌(excretory-secretory，ES)抗原進(jìn)行血清學(xué)診斷時(shí)易與其他蠕蟲病發(fā)生交叉反應(yīng)。為了尋找敏感和特異的早期診斷抗原，我們前期將裂頭蚴可溶性抗原與ES抗原分別進(jìn)行了雙向電泳，應(yīng)用裂頭蚴早期感染血清進(jìn)行Western blotting鑒定，將早期感染血清識(shí)別的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析后鑒定出一種半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，CP)。CP是

3、在其活性中心具有半胱氨酸殘基的一種蛋白水解酶，具有良好的抗原性，在寄生蟲生長與發(fā)育中具有重要的生物學(xué)功能。本研究對(duì)裂頭蚴半胱氨酸蛋白酶(SeCP，ID：D63670；蛋白ID：BAA09820，GI:1834307)全長基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、克隆、原核表達(dá)，并對(duì)重組SeCP(rSeCP)進(jìn)行了免疫學(xué)鑒定、酶活性及功能特性分析，將其用于不同劑量裂頭蚴實(shí)驗(yàn)感染小鼠后不同時(shí)間血清特異性抗體的檢測(cè)，通過ELISA觀察了rSeCP診斷裂頭蚴病

4、人的敏感性與特異性。
　　材料與方法:
　　1.裂頭蚴、血清、質(zhì)粒和菌株
　　從河南省開封地區(qū)感染裂頭蚴的野生青蛙肌肉中分離裂頭蚴，按重度(5條/只)、中度(3條/只)、輕度(1條/只)分別感染小鼠，感染后2~28d隔天采集血清備用。裂頭蚴感染家貓后收集成蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定為曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni)。試驗(yàn)血清包括裂頭蚴、旋毛蟲、弓形蟲與日本血吸蟲感染小鼠血清，以及裂頭蚴病、棘球蚴病、

5、旋毛蟲病、日本血吸蟲病、并殖吸蟲病、華支睪吸蟲病、豬囊尾蚴病等寄生蟲病患者血清。克隆載體pGEM-T(Promega)、大腸桿菌 DH5α，原核表達(dá)載體 pMAL-c2X和 TB1均購自 New England Biolabs。
　　1. SeCP的生物信息分析及克隆、表達(dá)及鑒定
　　利用NCBI、EMBI、ExPasy等在線網(wǎng)站對(duì)SeCP進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后對(duì) SeCP基因進(jìn)行分子克隆、表達(dá)和純化，將純化后的 rSeC

6、P免疫 BALB/c小鼠獲得免疫血清并對(duì)其引起的免疫應(yīng)答類型進(jìn)行了觀察，通過 Western blotting分析其抗原性和免疫原性，應(yīng)用RT-PCR觀察SeCP基因在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期的轉(zhuǎn)錄情況；應(yīng)用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFT)對(duì)SeCP蛋白在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期的表達(dá)及其在蟲體組織的定位進(jìn)行了分析。
　　2. rSeCP酶活性鑒定及功能分析
　　將純化的 rSeCP進(jìn)行明膠酶譜分析(含有0.1％明膠的12% SDS-

7、PAGE)檢測(cè)其活性。采用 Z-Phe-Arg-AMC測(cè)定蛋白酶的活性以及酶動(dòng)力學(xué)分析，在激發(fā)波長為355 nm和發(fā)射波長為460 nm時(shí)檢測(cè)rSeCP催化生成的產(chǎn)物AMC的生成速率，進(jìn)而得到rSeCP的催化效率，并測(cè)定了溫度、pH、金屬離子(Cu、Mn、Zn)和特異性抑制劑(E-64等)對(duì)rSeCP活性的影響。分別應(yīng)用兔與人的免疫球蛋白、牛血紅蛋白(Hb)、纖連蛋白、膠原蛋白I與IV及牛血清白蛋白觀察rSeCP的水解功能。將rSeCP

8、與rSeCP免疫血清孵育后，觀察rSeCP免疫血清對(duì)rSeCP酶活性及水解功能的抑制作用，以及抗rSeCP抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用( ADCC)實(shí)驗(yàn)。
　　3. rSeCP用于裂頭蚴感染小鼠與裂頭蚴病人血清抗體的檢測(cè)
　　應(yīng)用rSeCP與裂頭蚴ES抗原分別建立檢測(cè)裂頭蚴抗體IgG的rSeCP-ELISA與ES-ELISA方法，檢測(cè)不同劑量裂頭蚴感染小鼠后不同時(shí)間血清抗體水平，觀察rSeCP-ELISA對(duì)裂頭蚴感染早期及輕

9、度感染的診斷效果。檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠、裂頭蚴病人及其他寄生蟲病人血清抗體水平，觀察rSeCP-ELISA診斷裂頭蚴病的敏感性與特異性。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0(SPSS Inc., Chicago, IL)處理數(shù)據(jù)和分析統(tǒng)計(jì)。OD值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同感染組及不同時(shí)間點(diǎn)的差異用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水平位α=0.05。
　　結(jié)果:<

10、br>　　1. SeCP的生物信息分析及克隆、表達(dá)及鑒定
　　SeCP基因序列全長1053bp，含有一個(gè)較大的1011bp ORF，編碼336個(gè)氨基酸，其中包括一個(gè)完整的組織蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域和一個(gè) peptidase_C1A conserved domain保守結(jié)構(gòu)域；含有信號(hào)肽序列，且具有良好的抗原性。利用克隆表達(dá)技術(shù)成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pMAL-c2X-SeCP/TB1，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白，且以可溶與包涵體2種形式

11、存在，應(yīng)用Amylose樹脂純化出目的蛋白。將純化后的rSeCP免疫BALB/c小鼠獲得免疫血清，ELISA檢測(cè)免疫血清的效價(jià)為1:106?？贵wIgG亞型分析發(fā)現(xiàn)，IgG1水平顯著升高，提示rSeCP免疫小鼠主要引起Th2型免疫反應(yīng)。Western blotting結(jié)果顯示，rSeCP可被裂頭蚴感染小鼠血清及rSeCP免疫血清識(shí)別，rSeCP免疫血清可識(shí)別裂頭蚴可溶性蛋白和ES蛋白中的天然成分。RT-PCR和 IFT結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，SeC

12、P基因在鼠體、蛙體裂頭蚴中均有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，但在成蟲期不轉(zhuǎn)錄也不表達(dá)，表明SeCP是裂頭蚴期特異性蛋白。SeCP蛋白主要定位在裂頭蚴的皮層與實(shí)質(zhì)組織。
　　2. rSeCP酶活性鑒定及功能分析
　　通過明膠基質(zhì)凝膠電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)rSeCP具有半胱氨酸蛋白酶活性，在蛋白對(duì)應(yīng)大小位置出現(xiàn)一條水解帶，水解作用能被E-64抑制。利用半胱氨酸蛋白酶特應(yīng)性底物Z-Phe-Arg-AMC測(cè)得rSeCP在 pH3.3至 pH8.5之間均具有活

13、性，并且在 pH為5.5時(shí)活性最高，最佳反應(yīng)溫度為37℃，測(cè)定米氏常數(shù)Km=1.56 nM/min，最大反應(yīng)速度 Vm=4.051 nM/min；rSeCP對(duì)底物Z-Phe-Arg-AMC的活性幾乎不被絲氨酸蛋白酶類抑制劑（ABESF、PMSF）和金屬蛋白酶類抑制劑（1,10-菲洛林，EDTA）所抑制，但能被E-64顯著性抑制；酶的活性被Cu、Mn及Zn離子抑制，而且具有劑量依賴性。rSeCP對(duì)免疫球蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白和牛血紅蛋白

14、均具有降解作用；在最適條件下，重組蛋白濃度越高，對(duì)基質(zhì)蛋白的降解越徹底；將抗rSeCP血清按1:50、1:100、1:500、1:1000稀釋后與rSeCP共孵育，酶的活性被抑制，具有劑量依賴性。ADCC實(shí)驗(yàn)顯示，抗rSeCP抗體對(duì)裂頭蚴具有殺傷作用。
　　3. rSeCP用于裂頭蚴感染小鼠后不同時(shí)間血清抗體的檢測(cè)
　　應(yīng)用rSeCP-ELISA對(duì)重、中、輕度裂頭蚴感染小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)rSeCP-ELISA首次檢測(cè)到

15、特異性抗體的時(shí)間分別為感染后10 d(20%，2/10)、10d(20%，2/10)和12 d(10%，1/10)；在感染后14d、22d和22d抗體陽性率均為100%，且抗體水平繼續(xù)逐漸升高直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的感染后28d；而ES-ELISA在重、中、輕度裂頭蚴感染小鼠首次檢測(cè)到特異性抗體的時(shí)間則分別為感染后6d(10%，1/10)、8 d(50%，5/10)和8 d(20%，2/10)，在感染后8d、12d和14dpi抗體陽性率均達(dá)到1

16、00%。兩種抗原的檢測(cè)結(jié)果均表明，3組裂頭蚴感染小鼠之間的抗體水平均隨著感染劑量的增大而升高，3組小鼠血清抗體水平之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FrSeCP=10.029, FES=5.901, P＜0.05)；感染后不同時(shí)間點(diǎn)之間抗體水平的差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FrSeCP=308.184, FES=601.727, P＜0.05)；感染時(shí)間和感染劑量之間存在交互關(guān)系(F rSeCP=4.266, FES=5.808, P＜0.05)。

17、r>　　4. rSeCP診斷裂頭蚴病的敏感性和特異性
　　應(yīng)用rSeCP-ELISA和ES-ELISA分別對(duì)裂頭蚴、弓形蟲、日本血吸蟲、旋毛蟲感染小鼠和正常小鼠血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種抗原檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠的抗體陽性率分別是96.67%(29/30) and100%(30/30)(P＞0.05)，與弓形蟲，旋毛蟲，血吸蟲感染小鼠血清均無交叉反應(yīng)。rSeCP-ELISA和 ES-ELISA檢測(cè)裂頭蚴病病人血清時(shí)抗體陽性率均為10

18、0%；rSeCP-ELISA檢測(cè)其他寄生蟲病人血清時(shí)，分別與囊尾蚴病、日本血吸蟲及并殖吸蟲病有1例(5.00%)交叉反應(yīng)，棘球蚴病、華支睪吸蟲病、旋毛蟲病及健康人血清均為陰性。應(yīng)用ES-ELISA檢測(cè)其他寄生蟲病人血清時(shí)，與棘球蚴病、囊尾蚴病、華支睪吸蟲病、日本血吸蟲病及并殖吸蟲病患者血清的交叉反應(yīng)率分別為15%(3/20)、5%(1/20)、28.57%(2/7)、10%(2/20)和65.00%(13/20)，旋毛蟲病人及健康人血清

19、均為為陰性。rSeCP-ELISA診斷裂頭蚴病人的特異性為98.22%(166/169)，明顯高于ES-ELISA的87.57%(148/169)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.構(gòu)建了裂頭蚴 SeCP基因的重組表達(dá)質(zhì)粒 pMAL-c2X-SeCP/TB1，誘導(dǎo)純化出可溶性rSeCP。SeCP基因只在曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴期轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在成蟲期和蟲卵期不表達(dá)，主要定位于蟲體皮層和實(shí)質(zhì)組織。
　　2. rSeCP具有良