轉基因植物外源基因的精確調(diào)控與安全轉化平臺研究.pdf

1、隨著分子生物學和生物技術的飛速發(fā)展，轉基因技術也取得了長足的進步，如何高效的獲得無選擇標記、穩(wěn)定可育、高安全性的轉基因植株成為植物遺傳轉化發(fā)展的方向。基因工程問世的30年來，植物遺傳轉化的技術也得到了飛速發(fā)展，遺傳轉化方法包括農(nóng)桿菌介導法、基因槍法(又稱微彈轟擊法)、電擊法、顯微注射法等，其中農(nóng)桿菌介導法以易操作、低費用、插入片段拷貝數(shù)低、不產(chǎn)生嵌合體、遺傳較穩(wěn)定等優(yōu)點而被廣泛應用。 本研究通過同源序列法分別從油菜(Brassi

2、ca napus)中克隆熱休克蛋白基因HSP81.1上游的啟動子序列、從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中克隆出細胞色素酶基因P450上游的啟動子序列，其中HSP81.1基因啟動子長2169bp，P450基因啟動子長2186bp，將這兩個啟動子分別與報告基因GUS融合并通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草，得到轉基因煙草植株，組織化學分析表明，油菜熱休克蛋白HSP81.1：基因在煙草中具有高溫誘導表達的能力。熱激處理后，不同生長時期的T1代轉基因煙草GUS染色

3、深淺不同，而且在煙草生長至50天時啟動子活性最高，而擬南芥細胞色素酶P450基因在煙草中并不存在空間特異性，在煙草的根、莖、葉都有不同程度的表達。 隨著生物技術的發(fā)展，轉基因作物的生物安全性問題在近年來受到人們的廣泛關注，其中有較大爭議的就是篩選標記基因，對于轉基因植株來說，篩選標記基因在獲得目的轉基因植株后已無用處。但這些隨目的基因整合進去的篩選標記基因卻存在潛在的生物安全性問題，如抗除草劑基因是否會造成超級雜草的出現(xiàn)而影響生

4、態(tài)平衡；抗生素標記基因是否會通過食物轉移至人、畜腸道微生物中，影響抗生素治療的效果。鑒于對轉基因作物選擇標記的安全性考慮，本研究構建了便于標記基因刪除的位點特異性載體Cre/loxP系統(tǒng)，分別用熱休克蛋白HSP81.1基因啟動子和泛組織表達的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子表達Cre酶基因；使用花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子表達GFP報告基因，該載體的選擇標記bar基因置于兩個同向的loxP位點之間，將三個載體分別通過農(nóng)桿菌介導法

5、導入煙草，并得到大量轉基因煙草植株，將含有Cre酶基因的轉基因煙草和含有l(wèi)oxP位點的轉基因煙草進行雜交，獲得無選擇標記的轉基因煙草。 轉基因作物的安全性問題不僅僅表現(xiàn)在選擇標記基因上，轉基因作物也可能成為超級雜草，而且有可能對近緣物種和野生種帶來潛在的影響。由于轉基因作物與非轉基因作物的生長期、花期、花時相同或相似，所以產(chǎn)生基因漂流的機會很大。另外，由于大多數(shù)轉基因作物與非轉基因作物的種子在外觀上難以區(qū)別，因此容易混雜在一起而

6、被傳播，可能會帶來難以預測的環(huán)境風險。因此，本研究從油菜( MS8RF3)基因組DNA中克隆出了解淀粉芽孢桿菌核糖核酸酶基因Bamase，將Bamase基因分別置于種子特異性表達的啟動子PNap和細胞色素酶P450啟動子的下游，成功構建了載體pBILoxp2 PNap TAibamase、pBILoxp2 P450TAibamase和pC1300 PNap Barstar L Bamase，分別將這三個載體通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草，其中