一種用于轉(zhuǎn)基因植物安全性控制的高效基因刪除系統(tǒng)“Gene-Deletor”的構(gòu)建.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文一種用于轉(zhuǎn)基因植物安全性控制的高效基因刪除系統(tǒng)“GeneDelet”的構(gòu)建姓名：羅克明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：作物遺傳育種指導(dǎo)教師：裴炎李義20040601摘要技術(shù)中，位點(diǎn)特異性重組酶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物中研究較多、應(yīng)用最為廣泛，但現(xiàn)有重組酶系統(tǒng)刪除效率最高也只能達(dá)到80％左右，同樣不能刪除所有外源基因，致使該系統(tǒng)難以應(yīng)用于生產(chǎn)中解決轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題。為了獲得高效的基因刪除系統(tǒng)，徹底刪除轉(zhuǎn)基因植物中所有的外源基

2、因解決轉(zhuǎn)基因植物可能帶來(lái)的生物安全性問(wèn)題，本論文針對(duì)現(xiàn)有重組酶系統(tǒng)存在的不足，對(duì)影響刪除效率的兩個(gè)關(guān)鍵因素：重組酶的特異性識(shí)別位點(diǎn)和重組酶基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，構(gòu)建了具有融合識(shí)別位點(diǎn)的高效基因自動(dòng)刪除系統(tǒng)。在轉(zhuǎn)基因煙草的花粉和種子中，所有外源基因都被100％地刪除，首次實(shí)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)基因植物中獲得非轉(zhuǎn)基因的花粉和種子，為解決由于轉(zhuǎn)基因植物花粉或種子擴(kuò)散引起基因逃逸的問(wèn)題，提供了一個(gè)可行的技術(shù)手段。該系統(tǒng)命名為“Gene—Deletor”。論

3、文主要研究結(jié)果如下：1識(shí)別位點(diǎn)對(duì)位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)刪除效率的影響在位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)Cre／loxP和FLP／FRT中，識(shí)別位點(diǎn)loxP和FRT是影響系統(tǒng)刪除效率的關(guān)鍵元件之一。為了弄清識(shí)別位點(diǎn)對(duì)刪除效率的影響，分別比較了含有單識(shí)別位點(diǎn)FRT和融合識(shí)別位點(diǎn)IoxPFRT的重組酶系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中的刪除效率。為此，構(gòu)建了四個(gè)表達(dá)載體，分別為：具有單識(shí)別位點(diǎn)FRT的載體(DpFBFGN(重組酶基因FLP由花粉特異性啟動(dòng)子Bgp啟動(dòng))和載

4、體(g)pFLCGN(重組酶基因Cre由花粉特異性啟動(dòng)子Lat52啟動(dòng))：具有融合識(shí)別位點(diǎn)IoxPFRT的載體匿)pLFBFGN和載體④pLFLCGN，重組酶基因FLP和Cre的表達(dá)同樣采用上述啟動(dòng)子控制。將各個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化煙草，分析了在轉(zhuǎn)基因植物花粉基因組中外源基因的刪除效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在含單識(shí)別位點(diǎn)fRr的重組酶系統(tǒng)中，具有重組酶Cre基因的pFLCGN系統(tǒng)和具有重組酶基因FLP的pFBFGN系統(tǒng)，最高刪除效率分別為343％和775