通心絡(luò)改善缺氧性腦損傷的作用機(jī)制.pdf

1、目的:通心絡(luò)對缺血缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究在動(dòng)物模型和細(xì)胞水平上研究通心絡(luò)對腦組織微血管缺氧性損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為通心絡(luò)用于防治缺血性腦損傷提供理論依據(jù)。
　　方法:選取雄性C57BL/6J小鼠，利用低壓氧艙制備缺氧性腦損傷動(dòng)物模型，給予通心絡(luò)灌胃處理后，冰凍切片觀察腦組織微血管內(nèi)皮緊密連接蛋白表達(dá)，CD31免疫熒光染色對微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行染色定位;在細(xì)胞水平上，將體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)

2、胞與通心絡(luò)預(yù)孵育，利用密封缺氧罐使細(xì)胞缺氧，取細(xì)胞爬片進(jìn)行緊密連接蛋白免疫熒光染色。利用Westernblot分析檢測緊密連接蛋白的表達(dá)變化。利用脂質(zhì)體將不同磷酸化位點(diǎn)突變的KLF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，檢測對緊密連接蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1通心絡(luò)通過增加血管內(nèi)皮緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)改善缺氧性腦損傷。
　　CD31與VE-cadherin、β-catenin、ZO

3、-1的免疫熒光雙染色結(jié)果顯示，與正常對照組相比，通心絡(luò)處理組的微血管緊密連接蛋白完整性好，內(nèi)皮染色更連續(xù)、線條更平滑。表明通心絡(luò)處理后腦組織微血管內(nèi)皮的緊密連接蛋白表達(dá)增加，血管內(nèi)皮完整性較好。缺氧組小鼠腦組織的微血管緊密連接蛋白表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致微血管緊密連接出現(xiàn)殘缺，表明缺氧導(dǎo)致了微血管損傷;缺氧動(dòng)物給予通心絡(luò)處理后，逆轉(zhuǎn)了小鼠腦組織微血管的緊密連接蛋白表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞緊密排布，血管內(nèi)皮完整性增強(qiáng)。以上結(jié)果顯示，通心絡(luò)可以促進(jìn)小鼠腦組

4、織微血管緊密連接蛋白的表達(dá)。
　　Westem blot分析結(jié)果顯示，與未經(jīng)通心絡(luò)處理的小鼠相比，通心絡(luò)處理組緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin的表達(dá)均有所增高，同時(shí)KLF4的表達(dá)也明顯上調(diào)。以上結(jié)果表明，通心絡(luò)通過增加內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1的表達(dá)，進(jìn)而緩解缺氧對小鼠腦組織的損傷。
　　2在缺氧條件下，通心絡(luò)能促進(jìn)體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadh

5、erin、β-catenin和ZO-1。
　　體外培養(yǎng)微血管內(nèi)皮細(xì)胞，取細(xì)胞爬片對緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin和ZO-1進(jìn)行免疫熒光染色。與對照組相比，通心絡(luò)處理組的內(nèi)皮細(xì)胞周圍的染色亮度較強(qiáng)，表明通心絡(luò)可以促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后，緊密連接蛋白表達(dá)明顯降低;通心絡(luò)預(yù)孵育可逆轉(zhuǎn)缺氧對緊密連接蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　Western blot分析結(jié)果顯示，與未經(jīng)通心絡(luò)處理

6、的細(xì)胞相比，通心絡(luò)處理組細(xì)胞的緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、 ZO-1表達(dá)均增高，KLF4的表達(dá)水平也明顯升高。
　　3通心絡(luò)通過促進(jìn)KLF4磷酸化上調(diào)緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)。
　　為了確定通心絡(luò)誘導(dǎo)緊密連接蛋白表達(dá)與KLF4磷酸化修飾之間的關(guān)系，利用免疫共沉淀檢測通心絡(luò)對KLF4磷酸化修飾的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，通心絡(luò)處理組的KLF4磷酸化水

7、平增高，變化趨勢與緊密連接蛋白變化相一致。表明通心絡(luò)是通過促進(jìn)KLF4磷酸化來促進(jìn)VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表達(dá)的。
　　4通心絡(luò)通過促進(jìn)KLF4分子中S444和S415的磷酸化上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)。
　　用不同的KLF4絲氨酸位點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染微血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察其對緊密連接蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染野生型GFP-KLF4和GFP-S444A、GFP-S415A點(diǎn)突變質(zhì)粒組，血管內(nèi)皮緊密連接

8、蛋白VE-cadherin、β-catenin、 ZO-1的表達(dá)均低于轉(zhuǎn)染GFP-N1空載體組;而轉(zhuǎn)染GFP-S470A點(diǎn)突變質(zhì)粒組，細(xì)胞內(nèi)三種緊密連接蛋白的表達(dá)與GFP-N1組相比無明顯差異。
　　內(nèi)皮細(xì)胞與通心絡(luò)預(yù)孵育24 h，再用KLF4絲氨酸位點(diǎn)突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后給預(yù)缺氧刺激12h。Western blot分析結(jié)果顯示，與對照組相比，通心絡(luò)孵育的內(nèi)皮細(xì)胞中KLF4表達(dá)顯著提高，緊密連接蛋白表達(dá)也同時(shí)上調(diào);與野生型GFP-

9、KLF4相比，在轉(zhuǎn)染GFP-S470A的細(xì)胞中緊密連接蛋白表達(dá)沒有明顯變化;在轉(zhuǎn)染GFP-S444A、GFP-S415A的細(xì)胞中，緊密連接蛋白VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表達(dá)顯著下降。
　　5通心絡(luò)通過激活A(yù)KT信號途徑促進(jìn)KLF4磷酸化。
　　對從腦組織和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，通心絡(luò)處理可使AKT磷酸化水平明顯增加。
　　體外培養(yǎng)的微血管內(nèi)皮

10、細(xì)胞與AKT抑制劑共孵育后，再檢測KLF4磷酸化修飾狀態(tài)，結(jié)果顯示，與單純通心絡(luò)處理組相比，給予AKT抑制劑后再用通心絡(luò)處理的細(xì)胞，KLF4的磷酸化水平降低。
　　結(jié)論:
　　1通心絡(luò)對缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用;
　　2通心絡(luò)增加微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá);
　　3通心絡(luò)通過促進(jìn)KLF4磷酸化上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá);
　　4通心絡(luò)促進(jìn)KLF4分子中S444和S415位點(diǎn)的磷酸化;
　　5通心絡(luò)通