缺血缺氧對(duì)腦組織和小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷機(jī)制及通心絡(luò)的干預(yù)作用.pdf

1、目的：缺血缺氧引起的腦損傷具有致殘率高、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn),雖然目前認(rèn)為氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是缺血缺氧性腦損傷的重要原因，但其確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，藥物治療效果也不太理想。通心絡(luò)（TXL）膠囊系根據(jù)古代醫(yī)家絡(luò)病理論，以益氣活血、通絡(luò)止痛為治療原則研制而成的中藥復(fù)方制劑。通心絡(luò)在心血管疾病的臨床治療上應(yīng)用廣泛且效果顯著；而且，各種臨床研究已證實(shí)，通心絡(luò)在老年腦動(dòng)脈硬化、頭痛、腦梗死等腦血管疾病的治療上也取得了良好的療效。雖然，通心絡(luò)對(duì)缺

2、血缺氧性腦損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究在動(dòng)物模型和細(xì)胞水平上研究通心絡(luò)對(duì)腦組織和小膠質(zhì)細(xì)胞缺血缺氧性損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為通心絡(luò)用于防治缺血缺氧性腦損傷提供有力的理論依據(jù)。
　　方法：選取雄性 ApoE-/-小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高脂飲食組和高脂+通心絡(luò)治療組。用高脂飼料飼喂ApoE-/-小鼠，制備動(dòng)脈粥樣硬化誘發(fā)的腦缺血缺氧動(dòng)物模型。通心絡(luò)治療組按7.5 mg/10 g體重每天給予通心絡(luò)超微

3、粉混懸液灌胃。對(duì)照組和高脂組每天灌服同等劑量的生理鹽水。連續(xù)灌注3個(gè)月后取材，TTC染色和HE染色檢查缺血性腦損傷動(dòng)物模型是否成功。TTC染色是評(píng)價(jià)腦缺血損傷的常用指標(biāo)，正常腦組織呈鮮紅色，梗死區(qū)腦組織呈蒼白色。利用Western blot和RT-PCR分析檢測(cè)腦組織HIF-1a、NRG-1、HO-1以及轉(zhuǎn)錄因子KLF5和KLF4的表達(dá)。在細(xì)胞水平上，用軟脂酸(C16:0）刺激神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2）不同時(shí)間后，利用Western bl

4、ot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞HIF-1a、NRG-1、HO-1以及轉(zhuǎn)錄因子KLF5和KLF4的表達(dá)。BV2細(xì)胞放入三氣培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)不同時(shí)間，利用Western blot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞HIF-1a、NRG-1、HO-1以及KLF5和KLF4的表達(dá)。細(xì)胞爬片經(jīng)免疫熒光染色檢查HIF-1a、NRG-1、HO-1、KLF5的表達(dá)。敲低KLF5，Western blot分析檢測(cè)HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：

5、⑴通心絡(luò)干預(yù)后，HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白和mRNA水平均顯著下調(diào)。TTC染色結(jié)果可見(jiàn)，正常對(duì)照組腦組織均勻紅染；高脂飲食組可見(jiàn)明顯的梗塞區(qū)域；高脂飲食+通心絡(luò)組梗塞區(qū)域顯著減少。HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，椎體細(xì)胞呈橢圓形，核仁明顯；高脂飲食組神經(jīng)元細(xì)胞高度水腫，呈空泡狀，細(xì)胞核濃染，固縮，梗塞中心區(qū)淡染，說(shuō)明神經(jīng)元細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷；通心絡(luò)組神經(jīng)元細(xì)胞損傷有所降低。以上結(jié)果表明，腦組織缺血模型制備成功。W

6、estern blot分析結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高脂組HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)明顯上調(diào)；與高脂組相比，高脂+通心絡(luò)組 HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)顯著下調(diào)。這說(shuō)明通心絡(luò)能部分逆轉(zhuǎn)缺血對(duì) HIF-1a、NRG-1和 HO-1的誘導(dǎo)作用。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，高脂組HIF-1a、NRG-1、HO-1的mRNA水平升高，而與高脂組相比，高脂+通心絡(luò)組HIF-1a、NRG-1、HO-1的m

7、RNA水平明顯下降，這與Western blot結(jié)果相一致。⑵以BV2細(xì)胞作為研究對(duì)象，BV2細(xì)胞經(jīng)軟脂酸C16:0刺激不同時(shí)間后，Western blot分析結(jié)果顯示，HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白表達(dá)隨著C16:0刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而增加； RT-PCR分析的結(jié)果也顯示，HIF-1a、NRG-1、HO-1的mRNA水平也隨著C16:0刺激時(shí)間的增加而升高。為了研究缺氧對(duì)BV2細(xì)胞的影響，BV2細(xì)胞放入三氣培養(yǎng)箱中進(jìn)行低氧培養(yǎng)不

8、同時(shí)間，然后，Western blot分析結(jié)果顯示，低氧以時(shí)間依賴(lài)性的方式誘導(dǎo)HIF-1a、NRG-1和HO-1表達(dá)；用RT-PCR對(duì)HIF-1a、NRG-1和HO-1 mRNA進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果與其蛋白質(zhì)水平的變化趨勢(shì)相一致。用不同濃度的TXL預(yù)孵育BV2細(xì)胞24 h，然后再低氧培養(yǎng)36 h，Western blot分析結(jié)果顯示，通心絡(luò)能夠濃度依賴(lài)性的逆轉(zhuǎn)由缺氧誘導(dǎo)的HIF-1a、NRG-1、HO-1的上調(diào)；用RT-PCR對(duì)相應(yīng) mRNA

9、進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果與其蛋白質(zhì)水平變化的趨勢(shì)相一致。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比，缺氧條件下培養(yǎng)36 h后， HIF-1a、NRG-1、HO-1免疫熒光染色強(qiáng)度顯著增加，與通心絡(luò)預(yù)孵育后再進(jìn)行缺氧培養(yǎng)，HIF-1a、NRG-1、HO-1免疫熒光染色強(qiáng)度顯著減少。這些結(jié)果表明，缺氧可以顯著誘導(dǎo)HIF-1a、NRG-1、HO-1表達(dá)，通心絡(luò)干預(yù)后，HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)均顯著下調(diào)。⑶Western blot分析結(jié)果顯

10、示，與正常對(duì)照組相比，高脂組小鼠的KLF5表達(dá)明顯上調(diào)；與高脂組相比，高脂+通心絡(luò)組的KLF5的表達(dá)顯著降低。而與正常對(duì)照組相比，高脂組和高脂+通心絡(luò)組的KLF4的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。用RT-PCR對(duì)KLF5和KLF4 mRNA進(jìn)行分析的結(jié)果與其蛋白質(zhì)水平的變化趨勢(shì)相吻合。這些結(jié)果說(shuō)明，缺氧誘導(dǎo)HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄因子KLF5的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。⑷在缺氧條件下培養(yǎng)BV2細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示，缺

11、氧以時(shí)間依賴(lài)的方式上調(diào)KLF5蛋白表達(dá)，但KLF4表達(dá)受缺氧影響不太明顯。用RT-PCR檢測(cè)KLF5和 KLF4 mRNA表達(dá)的結(jié)果與其蛋白水平的變化相一致。用不同濃度的TXL預(yù)孵育BV2細(xì)胞24 h后再缺氧培養(yǎng)36 h，由缺氧誘導(dǎo)的KLF5上調(diào)隨著TXL濃度的增加而逐漸逆轉(zhuǎn)，而KLF4隨著TXL濃度的變化其蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。同樣，mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果與蛋白水平的變化趨勢(shì)相一致。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧36 h后

12、，KLF5免疫熒光染色強(qiáng)度顯著增加，通心絡(luò)預(yù)孵育能使KLF5免疫熒光染色強(qiáng)度顯著減少。這些結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)HIF-1a、NRG-1和HO-1表達(dá)與其上調(diào)KLF5的表達(dá)有關(guān)。⑸由缺氧引起的HIF-1a、NRG-1、HO-1表達(dá)上調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄因子 KLF5的表達(dá)有關(guān)。為了進(jìn)一步探討 HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)是否受KLF5的調(diào)控，我們用靶向小鼠的KLF5 siRNA轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞，敲低KLF5表達(dá)后，檢測(cè)HIF-1a、NRG

13、-1、HO-1的蛋白表達(dá)。Western blot分析結(jié)果顯示，KLF5缺失消除了缺氧誘導(dǎo)的HIF-1a、NRG-1、HO-1的表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明，在缺血缺氧的腦組織和BV2細(xì)胞中，KLF5介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)HIF-1a、NRG-1和HO-1表達(dá)。
　　結(jié)論：①腦組織缺血缺氧可以誘導(dǎo)HIF-1a、NRG-1、HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)，通心絡(luò)干預(yù)后，HIF-1a、NRG-1、HO-1的蛋白和mRNA水平均顯著下調(diào)。②體外培養(yǎng)的BV