缺氧性腦損傷致癇性發(fā)作機制的實驗研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分 缺氧性腦損傷致癇性發(fā)作及其敏感性改變機制研究 第一節(jié) 大鼠缺氧性腦損傷模型建立和評價 目 的：大鼠缺氧性腦損傷(Hypoxic brain injury)模型建立和評價，為腦缺氧損傷相關(guān)病理生理機制研究提供實驗基礎(chǔ)。 方 法：采用成年雄性SD大鼠，以8％氮氧混合氣體缺氧后，觀察其行為學(xué)、腦電圖改變，并將腦組織行Nissle染色和電鏡檢測取材，采用光鏡和透射電鏡(Transm

2、ission electron microscope，TEM)觀察皮層和海馬病理學(xué)變化。 結(jié) 論：采用氮氧混合氣體對大鼠進行缺氧，建立缺氧性腦損傷模型，該模型可模擬缺氧性腦病后腦損害病理過程，為缺氧性腦病所致腦損傷及其相關(guān)病理生理機制研究提供動物模型。 第二節(jié) 缺氧性腦損傷致大鼠亞臨床癇性發(fā)作及海馬苔蘚纖維出芽 目 的：觀察缺氧性腦損傷后亞臨床癇性發(fā)作及其與海馬苔蘚纖維出芽(Mossy fiber spro

3、uting，MFS)和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(Glialfibrillary acidic protein，GFAP)關(guān)系，探討缺氧性腦損傷致癇性發(fā)作相關(guān)病理機制。 方 法：成年雄性SD大鼠隨機分為對照組(Control)(n=12)與缺氧組(Hypoxia)(n=91)，經(jīng)8％氧氮混合氣體缺氧，依據(jù)大鼠腦電活動變化，再將缺氧大鼠分成亞臨床癇性發(fā)作組(Subclinical seizures)與非亞臨床癇性發(fā)作組(Non-subcl

4、inical seizures)，并分別用Nissle染色、Timm染色、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)和免疫蛋白印記(Western blot)等方法觀察皮層、海馬神經(jīng)病理學(xué)改變，海馬MFS以及海馬，皮層GFAP表達。 結(jié)論：缺氧損傷可致大鼠癇樣放電，且癇樣放電大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)元丟失、海馬CA3區(qū)形成MFS以及腦內(nèi)GFAP表達增加，此病理變化可能與缺氧性腦損傷后亞臨床癇性發(fā)作有關(guān)。 第

5、三節(jié) 缺氧性腦損傷致大鼠癇性發(fā)作敏感性和腦內(nèi)PSD-95、VGluT1、VGluT2表達改變 目 的：觀察缺氧性腦損傷大鼠癇性發(fā)作敏感性，及其突觸后致密物質(zhì)-95(Postsynaptic density-95，PSD-95)，囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運載體-1，-2(Vesicular glutamate transporter subtype 1，subtype 2，VGluT 1，VGluT 2)免疫反應(yīng)改變以及相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元丟失

6、。探討缺氧性腦損傷致癇性發(fā)作敏感性改變的病理機制。 方法：成年雄性SD大鼠隨機分為對照組(Control)(n=35)和缺氧組(Hypoxia)(n=35)，以8％氧氮混合氣體建立大鼠缺氧性腦損傷模型。兩組各取大鼠(n=10)腹腔注射戊四唑(pentylenetetrazolPTZ)10mg/kg.5min檢測致癇性發(fā)作閾值；兩組再各取大鼠(n=15)腹腔注射PTZ 35mg/kg.2d，連續(xù)20d，進行大鼠點燃，檢測癲癇點燃大

7、鼠數(shù)目和癇性發(fā)作程度，兩組動物中經(jīng)PTZ點燃大鼠分別納入單純點燃組(Simple kindling)和缺氧后點燃組(Post-hypoxic kindling)。對照組和缺氧組剩余大鼠(n=10)與單純點燃組和缺氧后點燃組大鼠分別采用IHC和Western blot等方法觀察大鼠顳葉皮層、海馬和中腦神經(jīng)元脫失以及腦內(nèi)PSD-95，VGluT 1，VGluT 2免疫反應(yīng)改變。 結(jié)論：VGluT1免疫反應(yīng)性增加，腦內(nèi)PSD-95表達

8、降低，相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元顯著丟失。上述病理變化可導(dǎo)致癇性發(fā)作敏感性增加和腦內(nèi)興奮性增高，對缺氧腦損傷致癇性發(fā)作敏感性改變產(chǎn)生重要作用。 第二部分 缺氧誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮性與癇性發(fā)作改變研究 第一節(jié) 無血清原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元方法建立 目的：建立大鼠海馬神經(jīng)元無血清原代培養(yǎng)方法，檢測培養(yǎng)神經(jīng)元電生理特性，為體外研究提供實驗基礎(chǔ)。 方法：鈍性分離新生SD大鼠雙側(cè)海馬，經(jīng)酶消化及吸管吹打，采用添加B27的無血清培

9、養(yǎng)基培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元，動態(tài)觀察其形態(tài)學(xué)變化；通過免疫細胞化學(xué)檢測神經(jīng)絲(NF-200)和神經(jīng)元特異核蛋白(Neu-N)染色鑒定神經(jīng)元；將培養(yǎng)至第8-14d神經(jīng)元，采用膜片鉗全細胞記錄模式，檢測其電生理特性。 結(jié)論：采用大鼠海馬神經(jīng)元無血清原代培養(yǎng)方法，可在體外獲得狀態(tài)良好的海馬神經(jīng)元，且適用于膜片鉗記錄，并顯示出正常神經(jīng)元電生理特性。 第二節(jié) 不同缺氧持續(xù)時間誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元興奮性改變 目 的：探討不同缺氧持續(xù)

10、時間對海馬神經(jīng)元興奮性相關(guān)電生理特性的影響。 方 法：原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)(95％N2/5％CO2)混合氣飽和人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid，ACSF)灌流缺氧，選取灌流5、10、15、20、25、30、35、40min后8個時段，采用全細胞記錄模式測定不同時段神經(jīng)細胞膜電位，電流鉗下躍階電流(-60pA～+40pA，step=10pA，時長200ms)刺激，測定不同時段神經(jīng)細胞閾強度，

11、即誘發(fā)神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位的最低電流強度。對照組神經(jīng)元灌流(95％O2/5％CO2)混合氣飽和ACSF。 結(jié) 論：缺氧早期神經(jīng)細胞膜電位呈現(xiàn)超極化，閾強度增高，興奮性降低；隨缺氧程度加劇，神經(jīng)細胞膜電位呈現(xiàn)去極化，閾強度減低，興奮性增高。 第三節(jié) 急性缺氧對谷氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元癇性放電的影響 目 的：探討急性缺氧對谷氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元癇性放電的影響。 方 法：經(jīng)(95％N2/5％CO2)混合氣飽和ACSF

12、進行灌流原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)細胞30min建立急性細胞缺氧模型，采用全細胞模式記錄缺氧前(Pre-hypoxia)、缺氧(Hypoxia)、缺氧后10、20、30、40min(Post-hypoxic 10、20、30、40min)神經(jīng)細胞膜電位，膜電容及膜入路阻抗，以確定缺氧對神經(jīng)細胞膜電生理特性的影響；在電流鉗下，采樣程序為Gap-free模式，測定對照組(Control)、缺氧組(hypoxia)、谷氨酸組(Glutanate)和缺氧