Erbin在TGF-β信號通路介導的胰腺星狀細胞(PSC)EMT改變中的表達.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 組織塊法分離培養(yǎng)小鼠PSC
　　目的:利用組織塊法分離培養(yǎng)CP模型組和對照組PSC，并分析兩組分選細胞的差異。
　　方法:雨蛙素誘導制備小鼠CP模型，HE染色觀察胰腺纖維化改變;取CP組和對照組小鼠胰腺組織，胎牛血清清洗，剪切至小米粒大小貼壁培養(yǎng)，觀察兩組細胞及傳代前后細胞形態(tài)學差異，采用油紅O染色鑒定靜息態(tài)PSC，免疫細胞化學/熒光法標記α-SMA和Desmin，熒光定

2、量PCR對比靜息和活化PSCα-SMA和Desmin的mRNA表達量;利用免疫細胞化學/熒光法標記胰腺導管細胞標志物CK19和SOX9，及腺泡細胞標志物Chymotrypsin和Amylase。
　　結(jié)果:(1)HE染色:造模組胰腺發(fā)生纖維化改變，腺泡細胞導管化;(2)形態(tài)學觀察:貼壁4天細胞多呈類圓形或星形，核周環(huán)繞脂滴，傳代細胞體積增大，立體感消失，呈“星芒狀”，脂滴消失，CP組細胞形態(tài)體積小于對照組;(3)油紅O染色:CP組

3、和對照組早期細胞均染色，傳代細胞未著色;(4)免疫細胞化學/熒光:兩組細胞傳代后，α-SMA和Desmin標記均陽性，CK19、SOX9、Chymotrypsin、Amylase標記均陰性;(5)熒光定量PCR:對照組傳代細胞和CP組細胞α-SMAmRNA含量明顯高于對照組早期細胞。
　　結(jié)論:組織塊法可成功分選CP模型組和對照組PSC，且兩組貼壁早期細胞均為靜息狀態(tài)。
　　第二部分 Erbin及TGF-β1在CP模型組和對

4、照組PSC中的表達差異
　　目的:探討Erbin及TGF-β1在CP模型組和對照組PSC中的表達差異
　　方法:采用雨蛙素腹腔注射法制備CP模型鼠，組織塊法分離提取PSC，運用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)比較CP組和對照組PSC中Erbin及TGF-β1mRNA和蛋白表達量的差異。
　　結(jié)果:(1)CP組Erbin表達較對照組顯著升高，其轉(zhuǎn)錄水平為對照組的6.36倍，蛋白水平為對照組的6.79倍，P＜0

5、.05;(2) TGF-β1在CP組中的表達明顯高于對照組，其mRNA和蛋白分別為對照組的3.99倍和1.43倍，P＜0.05.
　　結(jié)論:Erbin和TGF-β1在胰腺纖維化過程中呈一致性升高，Erbin可能通過調(diào)控TGF-β1通路參與胰腺纖維化的發(fā)生。
　　第三部分 Erbin在TGF-β1誘導的EMT過程中的表達
　　目的:探討TGF-β1誘導PSC活化過程中是否發(fā)生EMT樣改變及Erbin和TGF-β信號通路在

6、PSC發(fā)生EMT過程中的表達變化。
　　方法:用10ng/ml TGF-β1刺激貼壁第4天PSC48h，觀察細胞形態(tài)改變，并采用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測TGF-β1處理前后細胞E-cadherin、α-SMA、Erbin及TGF-β信號通路靶點分子的表達變化。
　　結(jié)果:(1)TGF-β1處理過的PSC體積增大，立體感消失，脂滴減少、消失;(2) TGF-β1處理的細胞E-cadherin mRNA(

7、0.33∶1)和蛋白(0.07∶1)表達均下調(diào)(P＜0.05)，α-SMAmRNA(2.91∶1)和蛋白(3.40∶1)表達均上調(diào)(P＜0.05);(3)熒光定量PCR結(jié)果示，TGF-β1處理細胞Erbin（13.03倍）、TGF-β1（2.94倍）及其下游的Smad3（2.08倍）和ERK（2.99倍）rnRNA均表達增加(P＜0.05);(4)Western blot結(jié)果示，TGF-β1處理的細胞Erbin、TGF-β1、Smad3