STIM1和STIM2在TGF-β介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT過程中作用的研究.pdf

1、乳腺癌是威脅全球女性健康的一種疾病，近年來發(fā)病率不斷攀升，已經(jīng)成為女性腫瘤中死亡率最高的疾病。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致高死亡率的主要原因，轉(zhuǎn)移的發(fā)生通常伴隨著腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-Mesenchymal Transitions，EMT)是乳腺癌細(xì)胞從上皮表型轉(zhuǎn)化成間質(zhì)型細(xì)胞的一個(gè)現(xiàn)象。EMT的發(fā)生伴隨著許多的生理和病理的變化活動(dòng)，一些與EMT相關(guān)的生物標(biāo)志物發(fā)生了變化，如上皮標(biāo)志分子E-Cadherin表達(dá)

2、的減少;間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin、Vimentin表達(dá)的增多;EMT轉(zhuǎn)錄分子Snail，Slug和Twist表達(dá)的增多。生長因子TGF-β(Transforming Growth Factor-β)是一種EMT誘導(dǎo)因子，TGF-βⅠ和TGF-βⅡ形成復(fù)合體，激活Smad2和Smad3，并介導(dǎo)EMT的活動(dòng)。文獻(xiàn)報(bào)道，鈣電流可以影響EMT，特別是鈣庫調(diào)控的鈣電流（Store-Operated Calcium Entry，SOCE）。

3、基質(zhì)交感分子1（Stromal Interaction Molecule1，STIM1）是SOCE的重要組成部分，是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜上的一種蛋白，當(dāng)感應(yīng)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里的Ca2+濃度的減低時(shí)，它就會(huì)聚集并轉(zhuǎn)位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞質(zhì)膜交匯處的近膜區(qū)，打開SOCE通道，外鈣內(nèi)流?；|(zhì)交感分子2(Stromal Interaction Molecule2，STIM2)與STIM1是同系物，但是關(guān)于它的研究甚少而且具有爭(zhēng)議，有部分研究指出STIM2介

4、導(dǎo)SOCE，但又有實(shí)驗(yàn)指出STIM2會(huì)抑制SOCE，因此STIM2在SOCE中的作用需要深入研究。
　　目的:
　　關(guān)于STIM1與SOCE的關(guān)系的研究已經(jīng)相對(duì)清晰，但是在TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT后，STIM1、STIM2在其中又起著怎樣的作用仍需要深入研究。本實(shí)驗(yàn)主要是探究STIM1與STIM2在介導(dǎo)TGF-β產(chǎn)生的EMT之間的區(qū)別，并探討其影響轉(zhuǎn)移的鈣信號(hào)機(jī)制。
　　方法:
　　1.在Kmplot腫瘤患者預(yù)后

5、數(shù)據(jù)庫中檢測(cè)STIM1和STIM2在乳腺癌患者中的生存曲線。
　　2.采用慢病毒干擾和過表達(dá)STIM1與STIM2，并用嘌呤霉素進(jìn)行篩選。
　　3.采用免疫印跡法對(duì)干擾和過表達(dá)STIM1與STIM2的不同處理組進(jìn)行蛋白量的檢測(cè)，觀察干擾和過表達(dá)的效果。
　　4.采用Transwell方法，對(duì)TGF-β刺激24h后的不同處理組的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行侵襲力變化的觀察。
　　5.采用RT-qP

6、CR方法和免疫印跡法檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-Cadherin、Vimentin、Snail1，觀察不同處理組STIM1與STIM2的EMT的強(qiáng)弱。
　　6.采用膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察不同處理組的SOCE的大小。
　　7.采用Confocal實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組SOCE與非SOCE的大小。
　　結(jié)果:
　　1.Kmplot數(shù)據(jù)庫檢測(cè)到在乳腺癌臨床患者中STIM1與STIM2表達(dá)高的患者預(yù)后差。
　　2.免疫印跡檢測(cè)出慢

7、病毒干擾和過表達(dá)STIM1與STIM2效果顯著。
　　3.Transwell結(jié)果顯示乳腺癌細(xì)胞在干擾STIM1和干擾STIM2后侵襲力減弱，過表達(dá)STIM1和STIM2后侵襲力增強(qiáng)。
　　4.RT-qPCR方法和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞在TGF-β刺激24h后，干擾STIM1組和干擾STIM2組的EMT現(xiàn)象減弱，過表達(dá)STIM1組和STIM2組EMT增強(qiáng)。
　　5.膜片鉗和Confocal結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞在TGF

8、-β刺激24h后，干擾STIM1組和STIM2組的SOCE減小，過表達(dá)STIM1組和STIM2組的SOCE增強(qiáng)。而干擾和過表達(dá)STIM1組的非SOCE大小無顯著性差異，干擾STIM2組的非SOCE減小，而過表達(dá)STIM2組非SOCE增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)中，證明了STIM蛋白參與了乳腺癌細(xì)胞的TGF-β刺激后的EMT過程。區(qū)分了STIM1和STIM2在TGF-β刺激后的鈣電流中的作用，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)STIM1通過調(diào)節(jié)SO