東亞鉗蝎蝎毒rAGAP對肝癌細胞的生長抑制作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤之一，是導致人類死亡的主要原因之一。盡管目前已有多種HCC治療方式應(yīng)用于臨床，但由于存在的副作用，遠達不到人們的預(yù)期效果。中藥(traditional chinese medicine，TCM)在中國傳統(tǒng)治療中發(fā)揮了巨大作用，由于其存在治療HCC的潛力，因而吸引了研究者們的注意。眾多研究證實，TCM可以通過多種作用方式延緩腫瘤過程，改善

2、HCC患者的生存質(zhì)量。
　　東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽(Buthus martensii Karsch Analgesic-antitumoralpeptide，BmK AGAP)是從蝎毒多肽中分離出來的一種毒素。Bmk AGAP不僅具有鎮(zhèn)痛作用，還可以抑制多種惡性腫瘤的增殖，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡。因此重組鎮(zhèn)痛抗腫瘤多肽(recombinant analgesic-antitumoral peptide，rAGAP)可能成為一種

3、新型的抗腫瘤藥物，應(yīng)用于臨床治療。我們在建立rAGAP高效原核表達系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過蛋白質(zhì)變復性和超濾截留技術(shù)，獲得高效的rAGAP蛋白，并通過體內(nèi)、體外實驗，研究其對HCC生長的抑制作用及具體機制。
　　方法：
　　1、通過構(gòu)建rAGAP基因工程載體，建立rAGAP高效原核表達系統(tǒng)，誘導表達獲得包涵體。利用蛋白質(zhì)變復性技術(shù)，對獲得的包涵體洗滌、變性、復性，獲得高純度可溶性rAGAP蛋白。并利用超濾截留技術(shù)，對復性后蛋白進行

4、濃縮、透析，制備得到高濃度、高活性的rAGAP蛋白。
　　2、在體外通過MTT觀察rAGAP對人肝癌細胞株的生長抑制作用。通過流式細胞儀、Western-blot、qRT-PCR實驗方法，檢測rAGAP對人肝癌細胞周期的阻滯效應(yīng)。通過流式細胞儀、Hoechst33258染色、Western-blot、qRT-PCR實驗方法，檢測藥物對人肝癌細胞凋亡的誘導作用。
　　3、在體內(nèi)觀察rAGAP對裸鼠肝癌皮下移植瘤生長的抑制作用，

5、并通過Western-blot、免疫組化、TUNEL檢測rAGAP對肝癌組織細胞周期、細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、為了有效純化具有功能的rAGAP，我們設(shè)計了兩種His6標記rAGAP(N-氨基末端His6標記和C-羧基末端His6標記）的重折疊方法。能量優(yōu)化和分子動力學模擬結(jié)果證實，N-氨基末端直接參與了rAGAP核心區(qū)域的構(gòu)成。此外，His6標記的N-氨基末端能夠影響rAGAP整個蛋白的結(jié)構(gòu)，甚至能夠與rAGA

6、P疏水核心產(chǎn)生相互影響，這一結(jié)果被證實與rAGAP活性具有密切關(guān)系。此外，使用堿性His6標記N-氨基末端能夠使其漂浮于蛋白質(zhì)表面，從而影響蛋白質(zhì)表面的電荷分布;而His6標記的C-羧基末端，與蛋白質(zhì)融合的同時對蛋白質(zhì)分布沒有影響。
　　本研究制備方法得到的rAGAP產(chǎn)量為其他方法的4倍，反相高效液相色譜法分析，制備的rAGAP純度為95％。根據(jù)rAGAP同源模型分析發(fā)現(xiàn)，其可能屬于長鏈毒素，主要通過干預(yù)Na+通道而發(fā)揮其生物學活

7、性。電生理結(jié)果證實rAGAP能夠顯著抑制70％的TTX-R鈉離子電流，而TTX-R鈉離子電流與痛覺信號、腫瘤轉(zhuǎn)導具有密切關(guān)系。
　　2、體外實驗
　　(1) MTT結(jié)果顯示rAGAP對多種人肝癌細胞株的增殖均具有顯著抑制作用，并呈濃度依賴性。并且rAGAP對人肝癌HepG2細胞24h、48h、72h不同時間點的增殖也具有抑制作用，并具有時間依賴性。
　　(2)流式細胞儀、Westem-blot、qRT-PCR等檢測結(jié)果

8、顯示，rAGAP可以將人肝癌HepG2細胞周期阻滯在G1期，能夠上調(diào)p21、下調(diào)CDK2的蛋白表達水平，上調(diào)p53、下調(diào)CDK2、CyclinD1的mRNA表達水平。我們推測rAGAP可能是通過調(diào)控p21、p53、CDK2、CyclinD1等細胞周期相關(guān)基因發(fā)揮其阻滯細胞周期的作用。
　　(3)流式細胞儀、Hoechst33258染色、Western-blot、qRT-PCR等檢測結(jié)果顯示，rAGAP可以誘導細胞發(fā)生早期凋亡，并能

9、夠上調(diào)Bax、PARP，下調(diào)Bcl-2、survivin等凋亡基因的蛋白表達;上調(diào)FADD、CRADD基因的mRNA表達。研究還發(fā)現(xiàn)，rAGAP可以下調(diào)磷酸化ERK1/2和STAT3的蛋白水平，下調(diào)STAT3的mRNA水平，而他們是許多凋亡基因的上游基因，因此我們猜測，rAGAP可能通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、survivin、PARP、FADD、CRADD、ERK1/2和STAT3等基因發(fā)揮其誘導肝癌細胞凋亡的作用。
　　3、體

10、內(nèi)實驗
　　(1)通過對裸鼠肝癌皮下移植瘤的腫瘤體積及裸鼠體重分析顯示，rAGAP能夠顯著的抑制裸鼠肝癌皮下移植瘤的增殖，并較5-FU組具有用藥劑量小的優(yōu)勢。
　　(2) Western-blot結(jié)果顯示，rAGAP高劑量組（2mg/kg）可以上調(diào)p53，下調(diào)Cyclin D1的蛋白表達，且對p53的結(jié)果優(yōu)于5-Fu組，因此我們推測，rAGAP在肝癌組織中可能通過調(diào)節(jié)p53及Cyclin D1發(fā)揮阻滯細胞周期的作用。

11、　　(3) TUNEL結(jié)果顯示，rAGAP組中凋亡細胞的數(shù)目明顯增加，rAGAP可以誘導肝癌組織發(fā)生凋亡。Western-blot結(jié)果證實，rAGAP低、高劑量組(1、2mg/kg)與模型組比較可以顯著上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2基因的蛋白表達水平，且藥物高劑量組對Bax調(diào)節(jié)的趨勢優(yōu)于5-Fu組。免疫組化結(jié)果顯示，rAGAP低、高劑量組(1、2mg/kg)與模型組比較，剪切的caspase3陽性表達明顯增多。因此，我們推測，rAGAP可以