海生素對肝癌的抑制作用及機制研究.pdf

1、肝細胞癌(Heptocellular carcinoma,HCC)是發(fā)病率最高的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤。盡管目前對肝癌可以采取手術(shù)切除、動脈插管化療、放療及局部治療等方法,但效果欠佳,人們一直在尋找一種有效治療肝癌的措施。惡性腫瘤的形成與腫瘤細胞增殖、凋亡調(diào)控信號失衡有關(guān),誘導肝癌細胞凋亡是治療肝癌的重要策略。此外,肝癌血供非常豐富,血管生成對腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移都有決定性的作用,而且在發(fā)病早期就有血管侵犯和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的傾向,這是肝癌預后差

2、的重要原因。誘導肝癌細胞凋亡和抑制肝癌新生血管形成將是治療肝癌的重要途徑。
　　 海生素是自海洋貝類毛蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)中提取出的抗腫瘤活性物質(zhì),在課題組以往的研究中得知海生素對白血病細胞K562、肺癌細胞A549和腎癌細胞OS-RC-2有抑制作用,并能抑制小鼠艾氏腹水瘤。而海生素誘導肝癌細胞的凋亡,以及抑制肝癌新生血管形成則是本次研究的重點。
　　 首先,觀察海生素對體外肝癌細

3、胞生長的抑制作用,通過對細胞凋亡相關(guān)分子、細胞信號轉(zhuǎn)導相關(guān)分子的檢測探討其可能的效應機制。以MTT法檢測48h不同濃度海生素對人肝癌細胞BEL-7402增殖的OD值,根據(jù)OD值計算細胞生長抑制率,實驗結(jié)果表明海生素能劑量依賴性抑制肝癌細胞BEL-7402的增殖。電鏡結(jié)果提示海生素能明顯誘導BEL-7402細胞凋亡,出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、碎裂,線粒體空泡化及凋亡小體等凋亡特征性改變。100μg/ml海生素作用48h后,流式細胞儀PI染色凋亡率為

4、29.63±1.09％,能明顯誘導細胞凋亡;Hoechst 33258熒光染色法呈現(xiàn)出凋亡核固縮形態(tài),可見典型的凋亡小體。在證明凋亡發(fā)生的基礎上,進一步進行海生素誘導凋亡的機制研究。RT-PCR.和Western Blot檢測海生素作用后BEL-7402細胞Fas mRNA和蛋白的表達,隨著海生素濃度增加Fas mRNA以及蛋白表達量增多。提示海生素誘導BEL-7402凋亡可能和Fas表面受體通路有關(guān)。進一步用western blot方

5、法檢測其下游信號分子的表達和活化情況,結(jié)果表明海生素能引起caspase-8和caspase-3的活化,以及細胞色素C的釋放;而用caspase-8抑制劑z-IETD-fmk事先孵育后,caspase-8和caspase-3的活化片段明顯減少,表明海生素可能通過Fas通路及線粒體信號通路誘導肝癌細胞BEL-7402的凋亡。
　　 其次,由于體外環(huán)境的局限性,應用荷瘤裸鼠動物模型進一步研究海生素體內(nèi)抑瘤效應及其可能的作用機制。用皮

6、下接種BEL-7402細胞的方法建立了裸鼠荷瘤模型,62.5mg/kg、125mg/kg、250mg/kg海生素腸溶膠囊組的抑瘤率分別為50％、58％和60％,相對腫瘤增殖率分別為45％、42％和32％,表明海生素腸溶膠囊對荷人肝癌裸鼠移植瘤BEL-7402的生長有明顯的抑制作用。HE結(jié)果顯示,海生素組的腫瘤組織出現(xiàn)細胞凋亡和壞死現(xiàn)象,電鏡結(jié)果表明海生素引起移植瘤組織中的肝癌細胞發(fā)生凋亡的特征性改變,從而從形態(tài)學證實海生素作用后腫瘤細胞

7、發(fā)生了凋亡。原位雜交技術(shù)檢測到移植瘤組織中Fas mRNA的表達在海生素用藥后明顯增加,免疫組織化學法檢測到移植瘤組織中caspase-8、caspase-3蛋白表達增加。進一步證明,海生素通過Fas信號通路誘導BEL-7402細胞凋亡。
　　 最后,觀察海生素對肝癌新生血管形成的抑制作用。以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)為研究對象,用MTT實驗結(jié)果表明

8、海生素抑制HUVEC的增殖活性,并且用Transwell小室法和管腔形成實驗觀察到海生素能明顯抑制HUVEC的遷移和管腔形成,表明海生素能夠直接抑制內(nèi)皮細胞。體內(nèi)試驗選用雞胚尿囊膜實驗,觀察到海生素對雞胚尿囊膜新生血管也有明顯的抑制作用。微血管密度(microvessel density,MVD)是反映腫瘤血管形成的比較直觀的指標,用CD34分子免疫組織化學法觀察到海生素用藥組裸鼠移植瘤組織MVD明顯減少。與血管形成有關(guān)的血管內(nèi)皮細胞生