海生素對(duì)肝癌的抑制作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Heptocellular carcinoma,HCC)是發(fā)病率最高的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤。盡管目前對(duì)肝癌可以采取手術(shù)切除、動(dòng)脈插管化療、放療及局部治療等方法,但效果欠佳,人們一直在尋找一種有效治療肝癌的措施。惡性腫瘤的形成與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控信號(hào)失衡有關(guān),誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡是治療肝癌的重要策略。此外,肝癌血供非常豐富,血管生成對(duì)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移都有決定性的作用,而且在發(fā)病早期就有血管侵犯和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的傾向,這是肝癌預(yù)后差

2、的重要原因。誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和抑制肝癌新生血管形成將是治療肝癌的重要途徑。
　　 海生素是自海洋貝類毛蚶(Tegillarca granosa Linnaeus)中提取出的抗腫瘤活性物質(zhì),在課題組以往的研究中得知海生素對(duì)白血病細(xì)胞K562、肺癌細(xì)胞A549和腎癌細(xì)胞OS-RC-2有抑制作用,并能抑制小鼠艾氏腹水瘤。而海生素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡,以及抑制肝癌新生血管形成則是本次研究的重點(diǎn)。
　　 首先,觀察海生素對(duì)體外肝癌細(xì)

3、胞生長的抑制作用,通過對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子的檢測探討其可能的效應(yīng)機(jī)制。以MTT法檢測48h不同濃度海生素對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖的OD值,根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞生長抑制率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海生素能劑量依賴性抑制肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖。電鏡結(jié)果提示海生素能明顯誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡,出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、碎裂,線粒體空泡化及凋亡小體等凋亡特征性改變。100μg/ml海生素作用48h后,流式細(xì)胞儀PI染色凋亡率為

4、29.63±1.09％,能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Hoechst 33258熒光染色法呈現(xiàn)出凋亡核固縮形態(tài),可見典型的凋亡小體。在證明凋亡發(fā)生的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步進(jìn)行海生素誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究。RT-PCR.和Western Blot檢測海生素作用后BEL-7402細(xì)胞Fas mRNA和蛋白的表達(dá),隨著海生素濃度增加Fas mRNA以及蛋白表達(dá)量增多。提示海生素誘導(dǎo)BEL-7402凋亡可能和Fas表面受體通路有關(guān)。進(jìn)一步用western blot方

5、法檢測其下游信號(hào)分子的表達(dá)和活化情況,結(jié)果表明海生素能引起caspase-8和caspase-3的活化,以及細(xì)胞色素C的釋放;而用caspase-8抑制劑z-IETD-fmk事先孵育后,caspase-8和caspase-3的活化片段明顯減少,表明海生素可能通過Fas通路及線粒體信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞BEL-7402的凋亡。
　　 其次,由于體外環(huán)境的局限性,應(yīng)用荷瘤裸鼠動(dòng)物模型進(jìn)一步研究海生素體內(nèi)抑瘤效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制。用皮

6、下接種BEL-7402細(xì)胞的方法建立了裸鼠荷瘤模型,62.5mg/kg、125mg/kg、250mg/kg海生素腸溶膠囊組的抑瘤率分別為50％、58％和60％,相對(duì)腫瘤增殖率分別為45％、42％和32％,表明海生素腸溶膠囊對(duì)荷人肝癌裸鼠移植瘤BEL-7402的生長有明顯的抑制作用。HE結(jié)果顯示,海生素組的腫瘤組織出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和壞死現(xiàn)象,電鏡結(jié)果表明海生素引起移植瘤組織中的肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的特征性改變,從而從形態(tài)學(xué)證實(shí)海生素作用后腫瘤細(xì)胞

7、發(fā)生了凋亡。原位雜交技術(shù)檢測到移植瘤組織中Fas mRNA的表達(dá)在海生素用藥后明顯增加,免疫組織化學(xué)法檢測到移植瘤組織中caspase-8、caspase-3蛋白表達(dá)增加。進(jìn)一步證明,海生素通過Fas信號(hào)通路誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡。
　　 最后,觀察海生素對(duì)肝癌新生血管形成的抑制作用。以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)為研究對(duì)象,用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

8、海生素抑制HUVEC的增殖活性,并且用Transwell小室法和管腔形成實(shí)驗(yàn)觀察到海生素能明顯抑制HUVEC的遷移和管腔形成,表明海生素能夠直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞。體內(nèi)試驗(yàn)選用雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn),觀察到海生素對(duì)雞胚尿囊膜新生血管也有明顯的抑制作用。微血管密度(microvessel density,MVD)是反映腫瘤血管形成的比較直觀的指標(biāo),用CD34分子免疫組織化學(xué)法觀察到海生素用藥組裸鼠移植瘤組織MVD明顯減少。與血管形成有關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生