葫蘆素B對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 肝癌是世界上最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤。肝癌的致死率在癌癥引起的死亡中占第3位,肝癌的預(yù)后主要取決于是否有轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)。因而抗肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移,減少術(shù)后復(fù)發(fā)成為當(dāng)今肝癌防治領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)的過(guò)程,包括粘附、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)或基底膜的降解等步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteina ses,MMPs)因能水解細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移而

2、引起人們的廣泛重視,其中MMP-9的過(guò)度表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMP-9的表達(dá)可以被很多刺激因素誘導(dǎo)表達(dá),這些刺激因素包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等。在這些刺激因素中,TPA廣泛被用來(lái)誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)。TPA是蛋白激酶C(PKC)的選擇性激活劑,PKC激活后,通過(guò)MAPK(ERK、JNK、p38)以及PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NK-κB和AP-1的活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)M

3、MP-9的基因表達(dá)。有多項(xiàng)研究證實(shí),抑制MMP-9的活性,可以預(yù)防腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此,尋找有效的藥物,抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是目前抗腫瘤研究的方向之一。
　　 葫蘆素B(cucurbitacinB)是從葫蘆科植物中提取的一類(lèi)高度氧化的四環(huán)三萜類(lèi)化合物,研究表明它具有抗腫瘤、抗化學(xué)致癌和抗炎等多種生物活性。體內(nèi)外研究表明,葫蘆素B能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,對(duì)于多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)葫蘆素B的抗癌作

4、用也做了大量的研究,發(fā)現(xiàn)葫蘆素B在體內(nèi)外對(duì)乳腺癌、喉癌、胰腺癌及肝癌都有很好的抑制作用。但是這些作用都是基于對(duì)葫蘆素B的抗增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制的研究,關(guān)于葫蘆素B的抗侵襲和轉(zhuǎn)移作用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要致力于葫蘆素B對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是否有抑制作用及其機(jī)制的研究。
　　 材料和方法：
　　 肝癌細(xì)胞系HepG2和BEL7402傳代培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)并計(jì)算葫蘆素B對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制率;不同濃度的葫蘆素B作用于

5、肝癌細(xì)胞系通過(guò)EMT和MET實(shí)驗(yàn),以及軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)觀察葫蘆素B對(duì)TPA作用后的肝癌細(xì)胞粘附作用的影響;通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn),transwell實(shí)驗(yàn)觀察葫蘆素B對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用;通過(guò)明膠酶譜和westernblot檢測(cè)葫蘆素B對(duì)TPA誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響。通過(guò)westernblot方法檢測(cè)MAPK(ERK1/2,P38,JNK),Akt,NF-gB,C-Fos,C-Jun等蛋白的表達(dá)的影響,探討葫蘆素B抑制TPA誘導(dǎo)的

6、肝癌細(xì)胞MMP-9表達(dá)可能的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同濃度的葫蘆素B和TPA作用于HepG2和BEL7402細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:200nMTPA和葫蘆素B在濃度低于1μM時(shí),對(duì)兩種細(xì)胞系的增殖率影響很小。軟瓊脂克隆形成:TPA能促進(jìn)HepG2細(xì)胞的克隆形成,葫蘆素B能顯著抑制TPA誘導(dǎo)的克隆形成。EMT結(jié)果顯示:TPA作用于貼壁后的HepG2細(xì)胞,顯微鏡下看到細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng),運(yùn)動(dòng)遷移能力增強(qiáng),葫蘆素B能

7、抑制這種現(xiàn)象。MET結(jié)果顯示:TPA能促進(jìn)細(xì)胞的粘附貼壁,而葫蘆素B能顯著抑制細(xì)胞的粘附貼壁。
　　 2、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell顯示TPA能顯著促進(jìn)兩種肝癌細(xì)胞的侵襲或轉(zhuǎn)移,葫蘆素B能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲或轉(zhuǎn)移。
　　 3、明膠酶譜和westernblot結(jié)果表明TPA能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MMP-9酶活性以及蛋白的表達(dá),葫蘆素B能抑制MMP-9的酶活性和蛋白的表達(dá)。TPA作用與HepG2細(xì)胞后,p-ERK1/2,p-