靶向Survivin的siRNA對鼻咽癌細(xì)胞生長抑制作用的研究.pdf

1、本文對靶向Survivin的siRNA對鼻咽癌細(xì)胞生長抑制作用進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：
　　目的：通過構(gòu)建靶向Survivin的shRNA真核表達(dá)載體的方法來探討RNAi技術(shù)對鼻咽癌細(xì)胞生長抑制作用，為鼻咽癌的基因治療提供新的實驗依據(jù)。
　　方法：以凋亡抑制基因Survivin為靶位，構(gòu)建表達(dá)小干擾 RNA(siRNA)的真核表達(dá)載體，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系 CNE-2，應(yīng)用RT-PCR檢測鼻

2、咽癌細(xì)胞中Survivin mRNA表達(dá)抑制情況，初步鑒定干擾效果。
　　結(jié)果：重組載體 pGPU6/GFP/Neo-shRNA1,2,3,4,N經(jīng)雙酶切和基因測序檢測,證實堿基序列與模板序列相符，無基因突變，載體構(gòu)建成功。重組載體經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生不同程度凋亡，轉(zhuǎn)染效率約為55％。RT-PCR方法初步鑒定其干擾效果，以Survivin/GAPDH的相對表達(dá)來表示Survivin

3、 mRNA的變化,各組的mRNA表達(dá)相差較大，24h測得的mRNA相對于轉(zhuǎn)染前有一定下降，大約在50%左右；但是隨著時間延長，重組質(zhì)粒的干擾作用逐漸減弱。
　　結(jié)論：本實驗通過構(gòu)建靶向 Survivin的shRNA真核表達(dá)載體的方法，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2，在一定程度上抑制細(xì)胞中Survivin的基因表達(dá)水平。證實了應(yīng)用RNAi技術(shù)對鼻咽癌細(xì)胞生長有一定程度的抑制作用，并為鼻咽癌的基因治療提供了新的實驗數(shù)據(jù)。

4、r>　　第二部分：
　　目的：通過化學(xué)合成的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)的方法來探討RNAi技術(shù)對鼻咽癌細(xì)胞生長抑制作用，為鼻咽癌的基因治療提供新的實驗依據(jù)。
　　方法：根據(jù)siRNA的設(shè)計原則設(shè)計針對survivin基因序列特異性的siRNA，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞。采用RT-PCR和Western blotting檢測Survivin在干擾后mRNA和蛋白的表達(dá)情況，并

5、篩選出干擾效果最好的siRNA序列進(jìn)行細(xì)胞生長抑制試驗（CCK-8實驗）檢測對細(xì)胞生長抑制作用。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染siRNA24h、48h和72h后，用RT-PCR和Western blotting檢測，CNE-2Z細(xì)胞survivin表達(dá)明顯下降，并篩選出抑制效果最好1號序列進(jìn)行CCK-8實驗，結(jié)果顯示能明顯抑制細(xì)胞生長增殖。
　　結(jié)論：靶向 Survivin的siRNA轉(zhuǎn)染人鼻咽癌 CNE-2細(xì)胞有效抑制細(xì)胞中Surviv