Lupeol對肝細胞肝癌的抑制作用及其機制研究.pdf

1、本文研究了Lupeol對肝細胞肝癌的抑制作用及其機制。本研究分為三個部分：
　　 第一章：lupeol誘導肝細胞肝癌細胞凋亡并抑制體內腫瘤生長。
　　 目的：研究lupeol體內外抗肝癌作用,從整體、細胞、分子水平探討其作用機制:研究其與rTrail聯(lián)合抗肝癌作用。
　　 方法：⑴采用MTT法研究luepol體外對HCC細胞系細胞增殖的抑制作用,采用人HCC細胞系SMMC7721細胞移植腫瘤裸鼠模型研究lupeo

2、l對體內腫瘤生長的抑制作用；⑵采用倒置顯微鏡、流式細胞術從形態(tài)學水平和生化角度檢測lupool對HCC細胞凋亡的誘導和細胞周期的影響,采用western blot方法分析其誘導凋亡的機制；⑶采用倒置顯微鏡觀察和流式細胞術從形態(tài)學水平和生化角度檢測lupeol與rTrail聯(lián)合對HCC細胞凋亡的誘導和細胞周期的影響,確定其聯(lián)合作用是否為協(xié)同作用。
　　 結果：①體外抑瘤結果顯示,lupeol能顯著抑制人HCC細胞增殖,并且具有量效

3、關系,作用48h的IC50為40μmol／L,-50μmolA,；體內模型抑瘤試驗結果顯示,lupeol能顯著抑制人HCC細胞系SMMC7721細胞移植腫瘤的生長；②形態(tài)學倒置顯微鏡觀察和流式細胞術結果顯示,lupeol能誘導HCC細胞凋亡,阻滯細胞周期進程；western blot結果顯示lupeol作用后使促凋亡蛋白caspase-3、cleaved-PARP活化上調,誘導胞內凋亡信號轉導；③形態(tài)學倒置顯微鏡觀察和流式細胞術結果顯示

4、,lupeol與rTrail聯(lián)合能抑制HCC細胞增殖,誘導HCC細胞凋亡,但其作用只具有累加性,不具有協(xié)同性。
　　 結論：lupeol在體外能誘導HCC細胞凋亡,并能抑制體內腫瘤生長；但其與rTrail聯(lián)合,只是具有相加作用,不具有協(xié)同性。
　　 第二章：Lupeol與P13K抑制劑S14161具有協(xié)同抗肝癌作用。
　　 目的：研究提高lupeol抗肝癌治療效果的方法；從細胞、基因、蛋白水平探討低濃度lupeo

5、l促進腫瘤生長的作用機制,通過聯(lián)合P13K信號通路抑制劑,來協(xié)同提高lupeol抗肝癌治療效果。
　　 方法：⑴對lupeol化學結構進行改造,采用MTT方法比較lupeol及其化學結構改造后衍生物對HCC細胞系細胞增殖的抑制作用；⑵采用MTT方法、流式細胞術方法對比lupeol及其衍生物H2在低濃度區(qū)間對HCC細胞增殖的抑制作用、對細胞凋亡的誘導作用,并采用RT-PCR、western blot方法研究其分子機制；⑶采用MTT

6、方法檢測P13K抑制劑S14161對HCC細胞增殖的抑制作用,選擇合適濃度,聯(lián)合低濃度lupeol,采用MTT方法檢測聯(lián)合用藥對HCC細胞增殖的抑制作用,并采用western blot方法研究其分子機制；⑷采用SMMC7721細胞移植腫瘤裸鼠模型,研究lupeol聯(lián)合S14161對體內腫瘤生長的抑制作用。
　　 結果：①MTT結果顯示,lupeol衍生物H1、T1、T2對HCC細胞增殖的抑制作用低于lupeol,lupeol對H

7、CC細胞作用的IC50為40μmol／L-50μmol／L,H1、T1、T2作用的IC50分別為大于120μmol／L、大約50μmol／L、70μmol／L-80μmol／L；而衍生物H2對HCC細胞增殖的抑制作用優(yōu)于lupeol,IC50小于30μmol／L；②流式細胞術、RT-PCR、western blot結果顯示,低濃度lupeol不能誘導HCC細胞凋亡,對胞內促凋亡分子及P13K／Akt信號通路關鍵分子的表達水平作用微小,而

8、低濃度H2能誘導HCC細胞凋亡,使胞內促凋亡分子表達上調及P13K／Akt信號通路關鍵分子表達下調；③MTT結果顯示,S14161對HCC細胞作用的IC50大約為4μmol／L,選取1μmol／L和3μmol／L兩個濃度,進行與lupeol的聯(lián)合用藥試驗；MTT結果顯示,lupeol與1μmol／L和3μmol／L S14161聯(lián)合,協(xié)同促進了對HCC細胞增殖的抑制作用,低濃度區(qū)間更為明顯；④western blot結果顯示,lupeo

9、l20μmol／L聯(lián)合S141611μmol／L和3τmol／L,協(xié)同下調了HCC胞內P13K／Akt信號通路的轉導；⑤腫瘤移植裸鼠模型體內聯(lián)合用藥結果顯示,lupeol與S14161協(xié)同抑制了體內腫瘤的生長。
　　 結論：低濃度lupeol促進腫瘤生長是由于激活了P13K／Akt通路。Lupeol和S14161單獨應用對HCC細胞增殖均有抑制作用,低劑量聯(lián)合有協(xié)同作用,聯(lián)合用藥提高了抗肝癌活性且無毒副作用。因而lupeol聯(lián)合

10、P13K信號通路抑制劑可能是更安全有效的抗腫瘤候選藥物,值得進一步研發(fā)。
　　 第三章：慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T細胞中可檢測到IL-35的表達。
　　 目的：檢測慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血CD4+T細胞中是否有IL-35的表達,為CHB發(fā)病機制的研究和臨床治療提供理論依據。
　　 方法：從CHB患者和健康人外周血中分離純化CD4+T細胞,抽提總RNA和總蛋白,通過RT-PCR和免疫共沉淀(IP)&w

11、estern blot方法,檢測IL-35 mRNA水平和蛋白水平的表達。
　　 結果：RT-PCR結果顯示,純化的CHB患者外周血CD4+T細胞中可檢測到IL-35 mRNA的表達；IP&western blot結果顯示,純化的CHB患者外周血CD4+T細胞中可檢測到IL-35蛋白的表達。而健康人檢測不到。
　　 結論：CHB患者外周血CD4+T細胞中IL-35的表達可能參與抑制機體抗HBV特異性免疫反應,更好的闡明了