MicroRNA-21與NK-T細胞淋巴瘤生長調控及臨床特征的關系.pdf

1、目的:通過研究人NK/T細胞淋巴瘤細胞株SNK-6細胞及NK/T細胞淋巴瘤患者外周血與健康志愿者外周血中miRNA-21表達量的差異，探究NK/T細胞淋巴瘤的臨床特征及預后與miRNA-21的相關性，以及miRNA-21與SNK-6細胞株生長發(fā)育的關系及作用機制，以期為NK/T細胞淋巴瘤的發(fā)病機制、治療策略提供理論依據(jù)及研究方向。
　　方法:
　　1、研究對象:選擇2013年～2015年間入河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院血液內科就診并

2、可以收集到完善臨床資料的NK/T細胞淋巴瘤患者外周血標本，以及采集于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院血液科健康志愿者的外周血標本作為對照組。人NK/T細胞淋巴瘤細胞株SNK-6細胞獲贈于鄭州大學第一附屬醫(yī)院張明智教授。
　　2、SNK-6細胞的培養(yǎng)及傳代:應用包含體積分數(shù)約為10％人AB型滅活血漿、1000u/ml的人重組白介素-2的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SNK-6細胞，并置于培養(yǎng)箱中，以恒溫37℃、飽和濕度及5％CO2條件孵育，48h傳

3、代1次。于細胞對數(shù)生長期生長良好，懸浮成團時進行研究。
　　3、實驗所需基因提取:應用miRNA提取盒提取患者、健康志愿者血液標本及SNK-6細胞中的miRNA，以及應用總RNA提取盒提取SNK-6細胞株中的總RNA，后將其反轉錄成為相應的cDNA置于-20℃冰箱中備用。
　　4、應用RT-PCR法檢測miRNA-21在外周血及SNK-6細胞中的表達水平。
　　5、應用瞬時轉染技術將SNK-6細胞中的miRNA-21進

4、行定向封閉沉默。
　　隨機將處于同一對數(shù)生長期SNK-6細胞分為空白組、封閉同源性siRNA對照組和封閉miRNA-21實驗組，設立封閉同源性siRNA對照組，以排除轉染試劑EndoFectionTM的細胞毒性對本實驗影響。
　　空白組正常培養(yǎng)，對照組細胞轉入siRNA-同源性序列，實驗組轉入siRNA-21，同等條件轉染48小時后提取三組細胞miRNA，再次應用RT-PCR方法檢測三組細胞中miRNA-21表達高低，明確該

5、條件下轉染是否成功。
　　5.1應用CCK-8方法觀察轉染成功封閉miRNA-21后實驗組生長趨勢。
　　取轉染48小時后三組細胞，調整密度為1*105/ml，按100μl/孔接種于U型96孔板，每組設5個復孔，孵育48h后各加入10μl的CCK-8試劑，置于37℃、飽和濕度及5％CO2條件的培養(yǎng)箱中孵育，于第30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h在酶標儀450nm條件下，測定各實驗組的吸光度值(OD值)，進行

6、統(tǒng)計學分析。
　　5.2應用RT-PCR檢測沉默miRNA-21前后細胞中PTEN、PI3K及AKT的mRNA表達水平的變化。
　　取轉染48小時后細胞，應用總RNA提取盒提取SNK-6細胞株中的總RNA，再次以RT-PCR方法檢測PTEN、PI3K、AKT的mRNA表達量。
　　6、將入組患者外周血miRNA-21表達量與其主要臨床特征進行相關性分析。
　　7、將所有試驗數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0統(tǒng)計軟件，進行統(tǒng)

7、計學分析，P＜0.05，認為有統(tǒng)計學意義。人NK/T細胞淋巴瘤患者及健康志愿者外周血兩組miRNA-21基因量根據(jù)正態(tài)分布與否應用t檢驗或非參數(shù)檢驗進行統(tǒng)計學分析，對miRNA-21的表達與NK/T細胞淋巴瘤患者臨床特征進行應用x2檢驗等頻率分析。
　　結果:
　　1、在外周血標本中，NK/T細胞淋巴瘤患者與健康志愿者組miRNA-21表達量存在統(tǒng)計學差異(P=0.000)，NK/T細胞淋巴瘤患者miRNA-21表達量高于健

8、康志愿者組，NK/T細胞淋巴瘤患者外周血中miRNA-21存在異常高表達。
　　2、在人NK/T細胞淋巴瘤細胞株SNK-6細胞中，miRNA-21的表達量與健康志愿者外周血對照組存在統(tǒng)計學差異(P=0.001)，人NK/T細胞淋巴瘤細胞株SNK-6細胞中miRNA-21的表達量較高，存在異常高表達。
　　3、在人NK/T細胞淋巴瘤細胞株SNK-6細胞中封閉miRNA-21后，CCK-8結果顯示空白組及封閉同源siRNA對照組

9、吸光值均與封閉miRNA-21實驗組吸光值存在差異（P=0.001、P=0.003），實驗組SNK-6細胞增殖活性明顯低于其他兩組。
　　4、在人NK/T細胞淋巴瘤細胞株SNK-6細胞中封閉miRNA-21后應用RT-PCR方法檢測到封閉miRNA-21實驗組細胞中PTEN的mRNA相對表達量較空白對照組升高，而PI3K、AKT的mRNA相對表達量較空白對照組降低，在NK/T細胞淋巴瘤中，miRNA-21調控PTEN-PI3K/A

10、KT通路的活性。
　　5、miRNA-21與NK/T細胞淋巴瘤臨床特征的分析:miRNA-21表達量高低與分期、骨髓受累與否、Ki-67、β2-MG、白蛋白水平存在統(tǒng)計學相關性。即隨著miRNA-21的表達越高，疾病分期越晚、骨髓受累幾率增加、Ki-67陽性率越高、β2-MG越高、白蛋白水平越低。
　　結論:
　　1、NK/T細胞淋巴瘤患者外周血及人NK/T細胞型淋巴瘤細胞SNK-6細胞中miRNA-21表達量存在異常