PTEN在NK-T細(xì)胞淋巴瘤中的表達及意義.pdf

1、NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NaturalKillerT-CellLymphoma，NKTCL)為非霍奇金淋巴瘤的一個亞型，發(fā)病率居T細(xì)胞淋巴瘤的首位，具有獨特流行病學(xué)分布特征，在東亞及拉丁美洲地區(qū)多見，而在歐美國家少見，具體的發(fā)病原因仍不明確，通常認(rèn)為與EB病毒感染及慢性鼻炎有關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為遺傳因素可能在其中起到一定的作用，是近年來淋巴瘤研究的熱門。
　　PTEN基因稱之為第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源性基因(phospha

2、taseandtensinhomologydeletedonchromosomeTen,PTEN)，是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)PTEN可能通過對酪氨酸的磷酸化的抑制作用、負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖作用，同時參與細(xì)胞周期的調(diào)控作用，其突變、缺失，蛋白表達異常，最終可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。PTEN的研究已成為腫瘤學(xué)特別是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤研究的熱點，但在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的研究較少，PTEN基因及其通路對NK/T細(xì)胞淋巴瘤有何生物

3、學(xué)特性影響及其分子機制還有待于進一步的研究。
　　本課題首先在臨床患者腫瘤組織標(biāo)本中檢測PTEN基因表達情況，然后利用慢病毒載體和RNAi技術(shù)，構(gòu)建分別攜帶PTENcDNA和shPTEN的重組慢病毒載體，感染NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，研究PTEN基因?qū)τ贜K/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的生長增殖、凋亡誘導(dǎo)、細(xì)胞周期、化療藥物敏感性等生物學(xué)特性的作用，同時檢測相關(guān)分子通路基因，探索PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的生物學(xué)功能和分子機制，為N

4、K/T細(xì)胞淋巴瘤的臨床診治提供潛在的分子標(biāo)志物和靶基因。
　　實驗?zāi)康?
　　1.檢測PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織以及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)組織表達情況，分析與臨床病理參數(shù)、療效之間的關(guān)系。
　　2.構(gòu)建并制備攜帶PTENcDNA和PTEN-shRNA的重組慢病毒載體，并進行相關(guān)功能鑒定。
　　3.檢測PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6和正常NK細(xì)胞中的表達，研究PTEN基因的表達對SNK-6細(xì)胞

5、生長增殖、凋亡、細(xì)胞周期、化療藥物敏感性等生物學(xué)特征的影響，檢測PTEN相關(guān)分子通路和耐藥基因的表達，初步明確相關(guān)分子機制。
　　主要內(nèi)容:
　　第一部分:PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達及意義
　　方法:
　　1.HE染色（蘇木精伊紅染色）:石蠟組織包埋切片進行脫蠟，染色，脫水后觀察NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中腫瘤細(xì)胞形態(tài)和組織學(xué)特點。
　　2.免疫組化檢測PTEN蛋白在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達:經(jīng)

6、過脫蠟，抗原修復(fù)，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，一抗孵育，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片過程，顯示在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PTEN的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞呈彌漫浸潤性生長，組織壞死明顯，粘膜面有潰瘍形成，腫瘤細(xì)胞形態(tài)單一、中等大小，胞質(zhì)淡染至透亮，浸潤并破壞血管壁。免疫組化結(jié)果顯示PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中陽性表達率為32.0％(16/50)，顯著低于反應(yīng)性增生淋巴結(jié)86.7％

7、(26/30)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PTEN陽性表達率與患者年齡、性別、發(fā)生部位、臨床分期、乳酸脫氫酶(LDH)水平均無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與Ki-67指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。根據(jù)療效評價（2周期）可將淋巴瘤患者分為治療有效組(CR+PR)和治療無效組(SD+PD)，結(jié)果顯

8、示PTEN在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達陽性率在有效組(42.1％)明顯高于無效組(16.1％)（P＜0.05）。
　　第二部分:攜帶PTENcDNA和shRNA重組慢病毒的制備和感染效率測定
　　方法:
　　1.PTEN高表達慢病毒載體構(gòu)建:將pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，PTEN克隆載體為模版PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建PTEN基因高表達慢病毒

9、載體pCDH-PTEN。
　　2.PTEN干擾表達慢病毒載體構(gòu)建及干擾效率篩選:設(shè)計合成PTEN基因shRNA，退火形成雙鏈片段，干擾慢病毒載體pLL3.7用HpaⅠ和XhoⅠ酶切，通過連接，轉(zhuǎn)化鑒定，構(gòu)建PTEN基因干擾慢病毒載體pLL-shPTEN1，pLL-shPTEN2和pLL-shPTEN3。通過RealtimePCR鑒定篩選出高效干擾的pLL-shPTEN。
　　3.慢病毒包裝，純化，濃縮及滴度測定:共轉(zhuǎn)染慢病毒

10、載體，包裝質(zhì)粒Δ8.2和包膜質(zhì)粒VSV-G于293T細(xì)胞中，72h收獲病毒，通過高速離心法進行純化濃縮病毒，通過梯度稀釋法進行滴度測定。
　　4.慢病毒對淋巴細(xì)胞感染效率測定:用不同MOI=0.1，1，10，100，1000對正常淋巴瘤細(xì)胞感染后通過熒光觀察測定綠色熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。通過流式細(xì)胞儀檢測有GFP表達的細(xì)胞比例。
　　結(jié)果:
　　1.pCDH-PTEN慢病毒表達載體酶切鑒定正確，測序結(jié)構(gòu)與NCBI中

11、參考序列一致，說明PTEN基因高表達慢病毒載體pCDH-PTEN構(gòu)建成功。
　　2.酶切及測序結(jié)果顯示pLL-shRNA1，pLL-shRNA2和pLL-shRNA3構(gòu)建成功，其中pLL-shRNA2干擾效率最高，選擇pLL-shRNA2進行下面病毒包裝。
　　3.通過慢病毒感染結(jié)果可知Lenti-con，Lenti-PTEN以及Lenti-shPTEN慢病毒包裝成功，并且純化濃縮后病毒滴度可以達到109IFU/ml。

12、>　　4.通過對SNK-6和YTS細(xì)胞的感染效率的測定發(fā)現(xiàn)當(dāng)MOI=100時病毒感染效率可以達到60％以上，可以滿足下游實驗需求。
　　第三部分:重組慢病毒Lenti-PTEN及Lenti-shPTEN功能測定和對SNK-6細(xì)胞生物學(xué)特性影響
　　方法:
　　1.RealtimePCR及WesternBlot分析正常NK細(xì)胞和SNK-6細(xì)胞中PTEN基因mRNA和蛋白表達水平。重組慢病毒Lenti-PTEN和Lenti

13、-shPTEN感染正常NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞和SNK-6細(xì)胞后，利用RealtimePCR及WestemBlot檢測PTEN基因表達。
　　2.重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞后，為評價PTEN基因?qū)α馨土黾?xì)胞生長抑制作用，進行形態(tài)學(xué)觀察和CCK8檢測細(xì)胞增殖能力變化。重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞和正常NK淋巴細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀通過細(xì)胞周期及凋亡檢測試劑盒分析PTEN基因?qū)θ肆馨土黾?xì)胞周期及凋亡的影響。重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞

14、和正常NK淋巴細(xì)胞后，通過不同濃度順鉑（8.0μg/mL、2.0μg/mL、0.5μg/mL、0.125μg/mL、0.03125μg/mL、0μg/mL）對細(xì)胞進行處理，CCK8檢測藥物作用后細(xì)胞增殖情況。
　　3.重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞，通過WesternBlot分析PI3K/AKT通路和耐藥基因蛋白表達量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.RealtimePCR以及westernblot分析結(jié)果表明均表明，PTE

15、N基因在正常NK細(xì)胞和NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6中均有表達，較正常NK細(xì)胞相比，SNK-6細(xì)胞中表達量明顯下降。另外，重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞后，高表達PTEN的重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞系后，SNK-6細(xì)胞中PTEN的表達明顯增高(P＜0.05)，干擾PTEN基因表達的重組慢病毒感染SNK-6細(xì)胞系后，SNK-6細(xì)胞中PTEN的表達明顯降低(P＜0.05)，降低了70％以上。
　　2.重組慢病毒Lenti-PTEN

16、作用后的淋巴瘤細(xì)胞不同程度出現(xiàn)細(xì)胞病理變化，即生長受到抑制，細(xì)胞分散，可見不同程度細(xì)胞碎片，細(xì)胞折光度欠佳，細(xì)胞攣縮。重組慢病毒Lenti-shPTEN作用SNK-6細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增長速度稍有增加，細(xì)胞狀態(tài)與對照組及Lenti-con相比差別不大。重組慢病毒Lenti-PTEN對于SNK-6細(xì)胞的抑制作用明顯(P＜0.05)，達到了42.03％±5.15，而重組慢病毒Lenti-shPTEN感染組相對Lenti-con組對SNK-6細(xì)

17、胞的增殖作用無明顯差異（P＞0.05）。重組慢病毒Lenti-PTEN可以通過誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡，抑制淋巴瘤細(xì)胞生長和增殖。不同濃度梯度DDP對SNK-6細(xì)胞作用呈現(xiàn)明顯濃度劑量依賴性，即隨濃度劑量的提高，DDP對細(xì)胞的增殖抑制率持續(xù)上升，重組病毒Lenti-con組和Lenti-shPTEN組細(xì)胞對DDP的增殖抑制率無明顯變化(P＜0.05)。重組慢病毒Lenti-PTEN感染后，細(xì)胞增殖抑制率較其他各組相比，抑制率均明顯提高（P＜0

18、.05），同時DDP對重組慢病毒Lenti-PTEN作用后SNK-6細(xì)胞的IC50值（0.0894±0.0073）較其他各組明顯下降(P＜0.05)，表明PTEN基因可以增強化療藥物順鉑對SNK-6細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　3.PTEN基因的高表達可以明顯抑制PI3K、p-Akt、mTOR、ABCC4基因的表達，但對MDR-1影響不明顯。
　　結(jié)論:
　　1.PTEN基因在NK/T細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞系中相對低表達。NK

19、/T細(xì)胞淋巴瘤組織中PTEN陽性表達率與Ki-67指數(shù)和療效呈負(fù)相關(guān)。提示PTEN可能與NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，并有可能作為療效判定的潛在分子標(biāo)志物。
　　2.成功包裝出三種重組慢病毒lenti-PTEN和lenti-shPTEN，可有效感染NK/T細(xì)胞淋巴瘤SNK-6和YTS細(xì)胞株，并顯著提高和降低NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SNK-6細(xì)胞中PTEN基因的表達。
　　3.PTEN基因的表達可以有效抑制SNK-6細(xì)胞