HER2單鏈抗體可變區(qū)表達與純化及抑制腫瘤細胞T6-17增殖的實驗研究.pdf

1、目的：構建 HER2-scFv表達載體，體外純化獲得 HER2-scFv蛋白，進而探討HER2-scFv抑制高表達HER2的腫瘤細胞系T6-17增殖，為下一步抗腫瘤研究奠定實驗基礎。
　　方法：①根據已有質粒pUC57-HER2-scFv為模板設計引物，采用PCR技術獲取目的基因 HER2-scFv。②運用雙酶切及分子克隆等技術將目的基因片段克隆入原核表達質粒 pET28a，構建 pET28a-HER2-scFv重組質粒。③重組質

2、粒pET28a-HER2-scFv轉化Rosetta大腸桿菌，利用IPTG誘導表達獲得HER2-scFv蛋白。④蛋白親和層析方法純化蛋白，進而對包涵體蛋白復性。⑤SDS-PAGE及Western blot證實IPTG誘導HER2-scFv蛋白表達。⑥實驗分為三組，分別為空白對照組，HER2-scFv組和曲妥珠單抗組。應用MTT法研究HER2-scFv對HER2陽性腫瘤細胞T6-17增殖的生長抑制作用。
　　結果：①PCR技術成功獲

3、得HER2-scFv目的基因。②構建的原核表達質粒載體pET28a-HER2-scFv，經鑒定證實插入序列方向大小正確，質粒構建成功。SDS-PAGE和Western blot證實IPTG誘導pET28a-HER2-scFv轉化的Rosetta大腸桿菌表達HER2-scFv蛋白成功，大小約為29KDa。獲得包涵體蛋白并復性，濃度為1358.3mg/L，純度約為90％，一升菌液可獲得蛋白約10mg左右。③MTT實驗檢測三組結果顯示：HER

4、2-scFv組抑制HER2陽性腫瘤細胞T6-17的抑制率為33.52%，與PBS組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000，P<0.05）；曲妥珠單抗組抑制HER2陽性腫瘤細胞T6-17的抑制率為34.79%，與PBS組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000，P<0.01）；而 HER2-scFv組與曲妥珠單抗組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.429，P>0.05）。
　　結論：①成功構建重組質粒pET28a-HER2-scFv。②重組質