99Tcm標記HER2親和體腫瘤顯像的實驗研究.pdf

1、目的：本研究將人表皮生長因子受體2（Human epidermal growth factor receptor2, HER2）親和體 ZHER2:2891的 C末端用四個氨基酸-G(Gly)GGC(Cys)作為螯合劑進行修飾，并對其進行放射性核素99Tcm標記，制備HER2親和體分子影像探針99Tcm-ZHER2:2891，測定該分子探針的標記率，評價其體內外穩(wěn)定性，應用HER2高表達的SKOV3細胞及荷瘤裸鼠模型進行細胞攝取實驗、體

2、內分布和顯像研究，并與HER2低表達的MCF-7細胞裸鼠進行顯像對比，探討分子影像探針99Tcm-ZHER2:2891對HER2高表達腫瘤診斷可行性。
　　方法：應用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZHER2:2891，并在其C末端連接4個氨基酸(-GGGC)，形成1個能與99Tcm進行強力螯合的類似N3S結構的短肽，利用配體交換法進行99Tcm標記。用反相高效液相色譜法(reverse-phase high performan

3、ce liquid chromatography, RP-HPLC)及紙層析法測定99Tcm標記的ZHER2:2891（99Tcm-ZHER2:2891）的標記率。并將該分子探針于37℃條件下分別在生理鹽水及人新鮮血清中孵育1、2、4、6、8h，用RT-HPLC測定其在不同介質及不同時間點中的放化純，以檢測其體外穩(wěn)定性。采用靜置貼壁法培養(yǎng)HER2高表達人卵巢癌SKOV3細胞及HER2低表達人乳腺癌MCF-7細胞，制備荷瘤裸鼠模型。收集處

4、于對數(shù)生長期的SKOV3細胞，用不含胎牛血清的培基配成單細胞懸液，使每0.2ml懸液中含細胞個數(shù)為1×107個，于SPF（specific pathogen free，無特定病原體）級BALB/c裸鼠右前肢外側皮下接種0.2ml單細胞懸液，待腫瘤直徑約1.5-2.0cm時，選取腫瘤大小無明顯差異的荷瘤裸鼠用于實驗。同樣方法于裸鼠左前肢外側皮下制備HER2低表達人乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠模型。將分子探針99Tcm-ZHER2:2891注射

5、入荷瘤裸鼠體內并收集注射分子探針后1.5-2h時的尿液，用RT-HPLC測定尿液中的放射性化學純度，以測定99Tcm-ZHER2:2891的體內穩(wěn)定性。研究該分子探針在 HER2高表達 SKOV3細胞的細胞攝取、滯留、內化及阻斷情況，以了解該探針在體外的藥代動力學及特異性。隨機取16只SKOV3細胞荷瘤裸鼠模型，利用隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組4只，各組分別經尾靜脈注射99Tcm-ZHER2:2891，于注藥后1、2、4、6h隨機取一

6、組動物模型，眼靜脈取血后，頸椎脫臼處死，即刻取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、小腸、肌肉、骨骼、腦、腫瘤分別測定其放射性計數(shù)并稱重，并同時測定標準源的放射性計數(shù)，計算每克組織中放射性計數(shù)與標準源的比值即％ID/g以及腫瘤與肌肉組織的%ID/g比值(tumor to muscle, T/M)。研究各時間點該分子探針在HER2高表達動物模型的體內分布。隨機取5只SKOV3荷瘤裸鼠，經尾靜脈注射99Tcm-ZHER2:2891，于注藥后1

7、、2、4、6、8h行靜態(tài)顯像，并行MCF-7荷瘤裸鼠顯像進行對比，觀察各組內隨時間變化腫瘤部位放射性濃聚的變化情況，利用感興趣區(qū)技術測定腫瘤部位放射性計數(shù)與對側同等區(qū)域正常部位放射性計數(shù)的比值(target to nontarget ratio, T/NT)，并比較2組間顯像的差異。另隨機取5只SKOV3裸鼠模型，在注射99Tcm-ZHER2:2891之前5分鐘，注射過量未標記的 ZHER2:2891進行阻斷特異性研究，于注藥后1、2、

8、4、6、8h行靜態(tài)顯像，觀察各組內隨時間變化腫瘤部位放射性濃聚的變化，計算T/NT比值，并與非阻斷組進行比較。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據以x±s(均數(shù)±標準差)表示，采用SPSS13.0及GraphPad Prism5.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析及統(tǒng)計圖制作，對數(shù)據進行兩樣本 t檢驗(或t'檢驗)或Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：經RP-HPLC檢測，99Tcm-ZHER2:2891放射峰保留時

9、間為11.66min,標記20min后標記率為（99.29±0.43）%（n=6），標記率較高，滿足體內顯像要求，無需進一步純化。于37℃水浴條件下，在生理鹽水及人新鮮血清中各孵育1、2、4、6和8 h，8h內分子探針放化純均在96%以上，且放射峰位置較穩(wěn)定，未見漂移。RP-HPLC測定注射99Tcm-ZHER2:2891后荷瘤裸鼠的尿液，保留時間呈雙峰，主峰與99Tcm-ZHER2:2891放射峰保留時間一致，主峰前一小的放射峰，該峰

10、與99TcmO4-保留時間不一致，為一代謝物峰，但并非游離99TcmO4-。
　　細胞實驗結果，人卵巢癌SKOV3細胞對99Tcm-ZHER2:2891的體外攝取率在1、2、4、6、8、12、24h分別為（5.27±0.32）%、（5.38±0.74）%、（5.74±1.03）%、（4.50±1.45）%、（5.68±0.95）%、（12.41±1.28）%、（10.79±2.46）%，表明攝取率隨著時間的延長逐漸增加，在6h時攝

11、取率稍有下降，但整體是上升趨勢，至12h達到最大值，之后略降低，但變化不大。人卵巢癌SKOV3細胞對99Tcm-ZHER2:2891的細胞滯留實驗結果，分子探針在細胞內滯留率相對較高可達51.30%。細胞內化實驗結果，隨著時間延長內化率整體呈曲線上升趨勢，表明99Tcm-ZHER2:2891與細胞膜上的HER2受體結合可轉入細胞內。阻斷組SKOV3細胞在加入99Tcm-ZHER2:2891同時分別加入500倍及1000倍過量的未標記的Z

12、HER2:2891，4h時的細胞攝取率從（5.74±1.03）%分別降到了（0.45±0.05）%、（0.38±0.04）%，有顯著性差異(t=-8.88，P=0.001；t=-9.01，P=0.001)，表明99Tcm-ZHER2:2891與HER2體外結合可被未標記的ZHER2:2891阻斷，探針具有靶向特異性。
　　荷瘤裸鼠體內分布結果，99Tcm-ZHER2:2891在HER2高表達SKOV3荷瘤裸鼠腫瘤組織內分布較高，在

13、1、2、4、6h分別為（4.14±1.61）（、6.47±2.09）、（5.04±2.58）、（10.07±0.33）%ID/g，其T/M比值由1h的4.87±0.47增長至6h的29.94±18.35。此外，除腎臟外，99Tcm-ZHER2:2891在大部分正常組織或器官中被快速清除。體內顯像實驗顯示，SKOV3荷瘤裸鼠注射99Tcm-ZHER2:28911h后腫瘤組織即有明顯放射性核素濃聚，隨時間延長濃聚程度增加，6h達攝取高峰，6

14、h與8h攝取沒有顯著差異。MCF-7細胞荷瘤裸鼠顯像，注藥后1h腫瘤部位無明顯放射性核素濃聚，之后可見輕度放射性核素濃聚，但未見明顯攝取高峰。兩組各時間點T/NT比值相比， SKOV3荷瘤裸鼠模型組明顯高于MCF-7荷瘤裸鼠模型組。注射未標記的ZHER2:2891可阻斷顯像效果，T/NT比值均較非阻斷組下降。
　　結論：99Tcm標記的HER2親和體ZHER2:2891標記方法簡便，標記率高，無需純化，可直接應用于動物體內顯像實驗