抑制腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)配體APRIL表達(dá)的抗腫瘤研究.pdf

1、目的： 增殖誘導(dǎo)配體(aproliferation-inducingligand，APRIL)屬腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)超家族成員之一，在正常組織中表達(dá)很弱，其主要功能為調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖和體液免疫反應(yīng)。但近年發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中卻有高水平表達(dá)，并且異位表達(dá)的APRIL具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長和誘導(dǎo)新生血管生成等作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此深

2、入研究APRIL分子的作用機(jī)制及其抑制劑的篩選，可為APRIL高表達(dá)相關(guān)的多種腫瘤治療提供新型候選制劑和藥物設(shè)計的新靶標(biāo)。本課題組多年來研究中藥單體、生物制劑和化療藥對腫瘤細(xì)胞的免疫修飾作用，并且在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡方面取得一定成果。在此基礎(chǔ)上，本研究將中藥單體淫羊藿苷(icarrin，ICA)、黃芩苷(baicali，BAI)聯(lián)合化療藥物多柔比星(doxorubicin，又稱ADM)作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，采用MTT、RT-P

3、CR以及免疫組化等方法從細(xì)胞、分子、基因水平探討這些藥物抑制HepG2細(xì)胞中APRIL以及bcl-2、VEGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的作用及機(jī)制，為這些中藥單體聯(lián)合化療藥的臨床抗腫瘤應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.MTT法檢測25μg/mlICA、200μg/mlBAI、2μg/mlADM以及12.5μg/mlICA+1μg/mlADM、100μg/mlBAI+1μg/m

4、lADM5個藥物處理組與未用藥對照組HepG2細(xì)胞的增殖活性；CD3AK細(xì)胞對5個用藥處理組和未用藥對照組HepG2細(xì)胞的殺傷活性；5組藥物作用后的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清與未用藥處理的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清相比，對血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖的影響。 2.RT-PCR法檢測APRIL及其受體HSPG在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況；經(jīng)5組藥物處理后HepG2細(xì)胞APRIL以及凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)水平的變化；經(jīng)CD3AK作用后，

5、HepG2細(xì)胞中bcl-2表達(dá)水平的變化；APRIL的相應(yīng)受體HSPG在ECV304細(xì)胞中的表達(dá)情況。 3.免疫組化檢測經(jīng)5組藥物處理后，與未用藥對照組相比，HepG2細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF表達(dá)水平的變化。 結(jié)果： 1.不同質(zhì)量濃度的ICA、BAI以及ADM作用48h后，對HepG2細(xì)胞具有增殖抑制作用，其中ICA25μg/ml，BAI400、200、100μg/ml，ADM16、8、4、2μg/ml

6、組與未用藥對照組(0μg/ml)相比，增殖抑制作用明顯(P＜0.01)。 2.25μg/mlICA、200μg/mlBAI、2μg/mlADM、12.5μg/mlICA+1μg/mlADM以及100μg/mlBAI+1μg/mlADM5個用藥處理組與未用藥對照組(0μg/ml)相比，對HepG2細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，且ICA、ADM、ICA+ADM、BAI+ADM組的增殖抑制作用呈明顯的時間依賴性，96h抑制率最高，抑制率

7、分別為(29.30±6.62)％、(63.60±1.35)％、(99.03±0.10)％、(98.89±0.18)％(均為P＜0.05)。 3.APRILmRNA及其受體HSPGmRNA在HepG2細(xì)胞呈高水平表達(dá)。 4.5個用藥處理組HepG2細(xì)胞APRIL基因mRNA與未用藥對照組相比，表達(dá)減少，相對定量值由對照組的0.71分別降至0.69、0.68、0.47、0.43、0.42。 5.5個用藥處理組HepG

8、2細(xì)胞bcl-2基因mRNA與未用藥對照組相比，表達(dá)減少，相對定量值由對照組的0.98分別降至0.77、0.79、0.81、0.70、0.69。 6.CD3AK對5個用藥處理組的HepG2細(xì)胞在效靶比為12.5:1時，24h殺傷率分別為(97.23±5.11)％、(93.12±9.88)％、(60.45±5.71)％、(43.87±8.2)％、(47.25±2.68)％明顯高于對照組的(30.00±4.50)％(均為P＜0.01

9、)。 7.CD3AK與5個用藥處理組的HepG2細(xì)胞作用后，HepG2細(xì)胞bcl-2mRNA表達(dá)相對定量值，對照組由0.98降至0.85，5個用藥組由對照組的0.85分別降至0.65、0.74、0.51、0.65、0.61，與CD3AK作用前相比，HepG2細(xì)胞bcl-2mRNA的相對表達(dá)值進(jìn)一步明顯下降。 8.免疫組化結(jié)果顯示，與未用藥對照組相比，HepG2細(xì)胞經(jīng)5個用藥組處理后，VEGF的表達(dá)明顯下降。 9.

10、HepG2細(xì)胞經(jīng)5個用藥組處理48h后，另加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)48h的上清與未用藥處理的對照組上清相比，對ECV304細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，抑制率分別為(2.79±5.57)％、(15.20±3.79)％、(12.10±4.50)％、(19.34±8.17)％、(20.27±4.77)％(均為P＜0.05)。 10.APRIL受體HSPGmRNA在ECV304細(xì)胞中呈高表達(dá)。 結(jié)論： 1.APRIL及其受體HS

11、PG在HepG2細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，APRIL可能是以自分泌形式作用于自身受體HSPG發(fā)揮其促腫瘤細(xì)胞增殖的活性。 2.ICA、BAI聯(lián)合ADM在降低APRILmRNA和凋亡相關(guān)基因bcl-2mRNA表達(dá)水平的同時，顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖活性，表明其下調(diào)APRIL、bcl-2mRNA表達(dá)水平可能是其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制。 3.ICA、BAI聯(lián)合ADM處理后的HepG2細(xì)胞，對CD3AK細(xì)胞的殺傷敏感性增強(qiáng)，逆轉(zhuǎn)

12、腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸作用。并且，CD3AK作用后，HepG2細(xì)胞bcl-2mRNA的表達(dá)水平進(jìn)一步明顯下降，表明CD3AK的殺傷機(jī)制與下調(diào)靶細(xì)胞的bcl-2mRNA表達(dá)水平有關(guān)。 4.HepG2細(xì)胞內(nèi)VEGF呈高水平表達(dá)；血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304內(nèi)APRIL受體HSPG呈高水平表達(dá)，表明HepG2細(xì)胞所產(chǎn)生的VE6F、APRIL可能是以旁分泌形式直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體，發(fā)揮其促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。 5.IC