Lipin-1在酒精性肝病發(fā)病機(jī)理中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于長期大量飲酒導(dǎo)致肝細(xì)胞中毒性損傷，肝臟病理改變最初表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性、肝炎、肝纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化。酒精性脂肪肝(alcohol fatty liver disease，AFLD)是ALD的早期表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)理主要為脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致大量沉積于肝細(xì)胞，從而引起肝細(xì)胞脂肪變性、炎細(xì)胞侵潤及纖維化等一系列病變[2]。近幾年研究結(jié)果顯示lipin-1在脂質(zhì)代謝過

2、程中具有促進(jìn)甘油三酯合成和脂肪酸氧化雙向調(diào)節(jié)作用。在細(xì)胞質(zhì)中，lipin-1作為Mg2+依賴性的磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid hosphohydrolase，PAP)酶促進(jìn)甘油三酯的合成;在細(xì)胞核中，lipin-1作為轉(zhuǎn)錄共刺激因子，一方面調(diào)節(jié)脂肪酸氧化;另一方面調(diào)控脂質(zhì)合成酶活性。在AFLD的肝細(xì)胞中，酒精通過AMPKSREBP-1-lipin-1信號(hào)通路上調(diào)lipin-1的總量表達(dá)，通過SIRT1-SFRS10-

3、Lpin1β/α軸上調(diào)Lpin1β/α的比例，lipin-1的高乙?；?低類泛素化其胞漿轉(zhuǎn)位，使細(xì)胞質(zhì)中的lipin-1β增多，細(xì)胞核中的lipin-1α減少。此外，酒精還可以直接促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ipin-1β的PAP活性，抑制lipin-1α在細(xì)胞核中的作用。綜上，TG合成增多促進(jìn)了脂質(zhì)在肝細(xì)胞中聚集促進(jìn)了AFLD疾病的進(jìn)展。本研究通過酒精灌胃建立大鼠ALD模型，用病理學(xué)方法觀察組織基本病變情況，通過分子生物學(xué)方法探討lipin-1在酒

4、精性肝病發(fā)病不同時(shí)間段的表達(dá)情況表達(dá)變化，為ALD防治提供一條新的思路。
　　方法:選用雄性Wister大鼠50只，體重200±20g，正常飼養(yǎng)7天，隨機(jī)分出10只為正常對照組，其余40只用酒精灌胃，采用逐漸增加酒精濃度(濃度30％-60％，乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法，分別于第4周末隨機(jī)處死10只大鼠、8周末9只、12周末8只、16周末8只;處死后立即取出肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱。分別應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連

5、反應(yīng)(RealTime-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)和Western blot法檢測剪切因子SFRS10和lipin-1（核、漿）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。
　　結(jié)果:
　　1、RT-qPCR法檢測SFRS10、總lipin-1、lipin-1α及l(fā)ipin-1β mRNA的表達(dá)。
　　1.1如Fig.1及Table2所

6、示，正常組大鼠肝組織中表達(dá)SFRS10較多，隨著造模時(shí)間的延長，其表達(dá)成逐漸減少趨勢，正常對照組與實(shí)驗(yàn)組，16周組與其它各組比較（0.64±0.04 VS0.54±0.03，0.42±0.05，0.35±0.03，0.20±0.05;0.20±0.05 VS0.64±0.04,0.54±0.03,0.42±0.05,0.35±0.03），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值為129.05，P＜0.01)。
　　1.2如Fig.2及Table2

7、所示，正常組大鼠組織中總的lipin-1、細(xì)胞質(zhì)lipin-1β及細(xì)胞核lipin-1α表達(dá)均較少，隨著造模時(shí)間的延長，總的lipin-1和lipin-1β表達(dá)量均逐漸增多，lipin-1α表達(dá)逐漸減少。正常對照組與實(shí)驗(yàn)組，16周組與其它各組比較（總lipin-1:0.20±0.03 VS0.29±0.04，0.42±0.04，0.48±0.03,0.55±0.04;0.55±0.04VS0.20±0.030.29±0.04,0.42±

8、0.04,0.48±0.03;lipin-1α:0.54±0.02VS0.47±0.03,0.32±0.03,0.23±0.03,0.18±0.02;0.18±0.02 VS0.54±0.02,0.47±0.03,0.32±0.03,0.23±0.03;lipin-1β:0.11±0.02 VS0.32±0.02,0.39±0.02,0.44±0.02,0.54±0.03;0.54±0.03 VS0.11±0.02，0.32±0.02，

9、0.39±0.02，0.44±0.02），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為104.55，250.22，379.63，P＜0.01）。
　　1.3如Fig.3及Table3所示，隨著造模時(shí)間延長，lipin-1β/α比值逐漸升高，正常對照組與實(shí)驗(yàn)組，16周組與其它各組比較（0.19±0.02 VS0.66±0.04，1.23±0.11,1.94±0.30,2.95±0.48;2.95±0.48 VS0.19±0.02,0.66±0.0

10、4,1.23±0.11，1.94±0.30，2.95±0.48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2、Westren blot法檢測SFRS10、總lipin-1、lipin-1α及l(fā)ipin-1β的蛋白水平表達(dá)。
　　2.1如Fig.5及Table3所示，正常組大鼠肝組織中表達(dá)SFRS10較多，隨著造模時(shí)間的延長，其表達(dá)量逐漸減少，正常對照組與實(shí)驗(yàn)組，16周組與其它各組比較（0.84±0.07 VS0.58±0.0

11、7，0.42±0.09，0.28±0.05;0.28±0.05 VS0.84±0.07，0.75±0.08，0.58±0.07，0.42±0.09），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值為66.53，P＜0.01），其中4周組與正常對照組相比（0.84±0.07 VS0.75±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.2如Fig.6及Table3所示，正常組大鼠組織中總的lipin-1、細(xì)胞質(zhì)lipin-1β及細(xì)胞核lipin-

12、1α表達(dá)均較少，隨著造模時(shí)間的延長，總的lipin-1和lipin-1β表達(dá)量均逐漸增多，lipin-1α表達(dá)逐漸減少。正常對照組與實(shí)驗(yàn)組，16周組與其它各組比較，總lipin-1:(0.25±0.06 VS0.41±0.07，0.52±0.05，0.77±0.10,0.85±0.05;0.85±0.05 VS0.25±0.06,0.41±0.07,0.52±0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值為99.60，P＜0.01)，其中16周與

13、12周比較(0.85±0.05VS0.77±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);lipin-1α:（0.59±0.05 VS0.44±0.05,0.31±0.03,0.17±0.02,0.10±0.03;0.10±0.03 VS0.59±0.05,0.44±0.05，0.31±0.03，0.17±0.02)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F值為177.14，P＜0.01);lipin-1β:0.13±0.03 VS0.25±0.05,0.3

14、9±0.03,0.69±0.05,0.74±0.05;0.74±0.05 VS0.13±0.03 VS0.25±0.05，0.39±0.03），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值280.47，P＜0.01)，其中16周與12周比較(0.74±0.05 VS0.69±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、酒精通過間接抑制SFRS10的表達(dá)從而影響lipin-1的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，總的lipin-1及細(xì)胞質(zhì)中