胱硫醚β合成酶在酒精性肝病發(fā)病機(jī)理中的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)是長(zhǎng)期大量飲酒所致的肝臟損害性病變，其病理改變包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化。關(guān)于ALD的發(fā)病機(jī)理目前尚不清楚，近年來有人提出以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”假說，“第一次打擊”使脂類沉積在肝細(xì)胞，導(dǎo)致脂肪肝，“第二次打擊”涉及內(nèi)毒素、細(xì)胞因子參與的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER

2、)作為細(xì)胞中蛋白成熟的場(chǎng)所，可以很敏感的感受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境改變，細(xì)胞就會(huì)激活信號(hào)應(yīng)對(duì)這些改變，并且重新恢復(fù)折疊蛋白的環(huán)境，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的這種改變就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ESR)，而對(duì)這種應(yīng)激作出的反應(yīng)就是非折疊蛋白反應(yīng)(UnfoldedProteinResponse，UPR)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白積聚所致，適宜的應(yīng)激有利于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的恢復(fù)，然而嚴(yán)重而持久的內(nèi)

3、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。肝細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最敏感的細(xì)胞之一，目前的研究也表明在細(xì)胞和動(dòng)物模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了酒精性肝病的發(fā)病過程。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose-regulatedprotein，GRP78)，又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，與熱休克蛋白70具有同源性，是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上最多的伴侶蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性分子，并且具有保護(hù)細(xì)胞、對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用。胱硫醚β合成酶(cystathionin

4、ebeta-synthase，CBS)，為吡哆醛磷酸依賴性酶，主要在肝臟合成，是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代謝過程中的關(guān)鍵酶，其活性的降低是高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)發(fā)生的主要誘因之一。同型半胱氨酸(Hcy)在CBS的作用下，以維生素B6為輔助因子，與絲氨酸結(jié)合形成胱硫醚，進(jìn)一步形成半胱氨酸和a-酮丁酸。Hhcy使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白增加，而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活非折疊

5、蛋白反應(yīng)。本研究旨在應(yīng)用酒精灌胃建立大鼠ALD模型，用比色法測(cè)定CBS活性，免疫組織化學(xué)染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)的方法觀察GRP-78蛋白及GRP-78mRNA的表達(dá)情況，探討CBS在ALD發(fā)病過程的表達(dá)及意義，為有效防治ALD提供新的思路。
　　 方法：選用雄性健康清潔級(jí)Wister大鼠50只，體重200±20g，正常飼養(yǎng)

6、1周后隨機(jī)分出10只為正常對(duì)照組，其余動(dòng)物采用逐漸增加酒精濃度（濃度30％-60％，乙醇5-9g·kg-1·d-1）的方法酒精灌胃，分別于4周、8周、12周和16周末隨機(jī)處死動(dòng)物10只、9只、8只和8只，留取血清及肝組織標(biāo)本；檢測(cè)血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL、VLDL、Hcy等生化指標(biāo)；取部分肝組織立即冰凍切片行蘇丹Ⅳ染色，觀察肝細(xì)胞脂變性情況；另取肝組織固定于4％中性福爾馬林溶液，石蠟包埋，5μm切片行蘇木精-伊紅（

7、hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝組織的普通病理改變，天狼紅染色觀察肝組織纖維化程度；并用石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察肝組織GRP-78蛋白表達(dá)情況；余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱，用RT-PCR觀察大鼠肝組織GRP-78mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1血清肝功能指標(biāo)的變化：隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，血清ALT和AST水平逐漸升高，CHE逐漸降低，與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01

8、。
　　 2血清血脂指標(biāo)的變化：隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐漸升高，HDL水平逐漸降低，與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　 3肝組織病理學(xué)改變：4周大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞脂肪變性，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞脂肪變性逐漸加重，肝小葉內(nèi)壞死灶明顯增多和纖維組織增生，16周大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫小泡性脂肪變性，竇周纖維化，匯管區(qū)纖維組織增生并有纖維間隔形成。冰凍切片蘇丹

9、Ⅳ染色顯示正常對(duì)照組大鼠肝組織無脂肪變性，模型4周組大鼠肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)少量紅色脂滴，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，紅色脂滴逐漸增多，至16周表現(xiàn)為大量紅色脂滴分布于肝細(xì)胞內(nèi)。PAS染色顯示正常組大鼠肝細(xì)胞胞漿中大量紫紅色顆粒分布，模型16周僅見少量紫紅色顆粒。天狼紅染色顯示模型4周組大鼠肝組織無明顯纖維組織增生，模型12周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯竇周纖維化和纖維化間隔形成趨勢(shì)，模型16周組大鼠肝組織出現(xiàn)明顯纖維間隔。
　　 4血清同型半胱氨酸

10、血癥的變化：隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，血清Hcy的水平逐漸升高，與正常對(duì)照組比較P＜0.05或P＜0.01。
　　 5比色法檢測(cè)大鼠肝組織CBS的表達(dá)：隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸降低，與正常對(duì)照組比較P＜0.05。
　　 6免疫組化法檢測(cè)大鼠肝組織GRP-78蛋白的表達(dá)：光鏡下，正常組大鼠肝臟內(nèi)表達(dá)較少的GRP-78蛋白，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)陽性表達(dá)逐漸增加，主要表達(dá)于肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，與正常對(duì)照組比較P＜0.05。
　

11、　 7RT-PCR法檢測(cè)GRP-78mRNA的表達(dá)量：正常組大鼠肝組織中表達(dá)GRP-78mRNA較少，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量逐漸增加，與正常對(duì)照組比較P＜0.05。
　　 8肝組織中的CBS相對(duì)表達(dá)量與血清Hcy水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.632，P＜0.01。
　　 9肝組織中CBS的相對(duì)表達(dá)量與肝組織中GRP-78的含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.936，P＜0.01。10肝組織中GRP-78的相對(duì)表

12、達(dá)量與Hcy的表達(dá)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.617，P值均＜0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1應(yīng)用逐漸增加酒精濃度和劑量灌胃的方法可以成功制備大鼠ALD模型，該模型肝臟病變?nèi)缰咀冃?、炎癥反應(yīng)和纖維化等可以反映臨床ALD的基本病變。
　　 2在酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制中，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，CBS活性逐漸降低，出現(xiàn)血清Hcy的水平逐漸升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性分子GRP78表達(dá)量逐漸增加。
　　 3ALD發(fā)