巨噬細(xì)胞源性TNF-α在肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分巨噬細(xì)胞源性TNF-α在肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究
　　研究背景和目的:原發(fā)性肝癌按照細(xì)胞來源通常分為三種類型:肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管癌(ICC)和混合型肝癌(CHC)。目前研究認(rèn)為HCC與ICC分別來源于肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，CHC主要來源于肝前體細(xì)胞。然而，HCC的高度異質(zhì)性及部分HCC表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物支持部分HCC來源于肝前體細(xì)胞的假說。研究人員對(duì)HCC的基因表達(dá)譜聚類分析發(fā)現(xiàn)，部分HCC具有肝母細(xì)胞或肝

2、前體細(xì)胞樣表達(dá)譜，提示肝前體細(xì)胞可能是HCC的來源之一。然而，目前對(duì)HCC的細(xì)胞來源尚存爭(zhēng)議，缺乏充足的科學(xué)證據(jù)。因此，HCC的細(xì)胞來源仍有待闡明，從而優(yōu)化HCC的病理分型，促進(jìn)肝癌的治療特別是個(gè)性化治療。
　　肝前體細(xì)胞，也叫卵圓細(xì)胞，具有分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的雙向分化潛能。當(dāng)肝臟發(fā)生慢性損傷時(shí)，如病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝病等，肝前體細(xì)胞會(huì)代償性活化。研究發(fā)現(xiàn)，從p53缺失小鼠分離的肝前體細(xì)胞能在裸鼠皮下形成腫瘤

3、;過表達(dá)Ras能使小鼠原代肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為肝癌起始細(xì)胞，均證明肝前體細(xì)胞可以作為肝癌起始細(xì)胞的來源。本科室前期研究也發(fā)現(xiàn)，TGF-β長期刺激能使肝前體細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，成為肝癌起始細(xì)胞，從而促進(jìn)肝硬化引起的肝癌發(fā)生。然而，肝前體細(xì)胞是否參與了慢性炎癥引起的肝癌發(fā)生仍不清楚，有待闡明。
　　慢性非可控性炎癥是肝癌發(fā)生的顯著特征及致病因素。越來越多的研究表明，炎癥在腫瘤發(fā)生過程中有多種作用，但其分子機(jī)制尚不十分清楚。枯否細(xì)胞即肝臟

4、組織中的巨噬細(xì)胞，是參與炎癥反應(yīng)最主要的炎性細(xì)胞，是重要的炎性因子TNF-α、IL-6的主要來源。Pikarsky等報(bào)道了在小鼠肝炎模型中TNF-α引起的NF-κB活化介導(dǎo)了肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。Karin等證明了IL-6/STAT3通路在肝癌發(fā)生中的重要作用。然而，巨噬細(xì)胞及其分泌的TNF-α、IL-6在肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用尚不十分清楚。
　　本課題的研究目的是探討巨噬細(xì)胞及其分泌的炎性因子TNF-α、IL-6在肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)

5、化中的作用及分子機(jī)制，不僅為肝癌發(fā)生提供新的思路，并且提出肝癌新的分子分型，為肝癌的個(gè)性化治療提供重要參考。
　　研究方法:
　　1.對(duì)CK19陽性HCC病人組織進(jìn)行肝前體細(xì)胞標(biāo)志物OV6的免疫組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)CK19陽性病人中OV6陽性的比例。
　　2.收集整理上述病人的臨床病理信息和預(yù)后隨訪信息，統(tǒng)計(jì)分析OV6表達(dá)與CK19+肝癌病人的臨床病理和預(yù)后的相關(guān)性。
　　3.建立大鼠DEN誘癌模型，通過免疫組化染

6、色研究在肝臟炎癥過程中肝前體細(xì)胞的活化情況，通過RT-PCR分析肝臟中炎性因子表達(dá)與肝癌起始細(xì)胞(T-IC)標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性。
　　4.采用免疫磁分選方法，從DEN大鼠第15周的肝臟中分選OV6陽性的肝前體細(xì)胞，進(jìn)行NOD-SCID鼠皮下接種，觀察肝前體細(xì)胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
　　5.在大鼠DEN誘癌的基礎(chǔ)上，建立GdCl3清除巨噬細(xì)胞模型，研究在肝癌發(fā)生中巨噬細(xì)胞對(duì)肝前體細(xì)胞的影響。
　　6.采用免疫磁分選方法，從

7、DEN/saline組和DEN/GdCl3組大鼠第15周的肝臟中分選肝前體細(xì)胞，研究清除巨噬細(xì)胞對(duì)肝前體細(xì)胞的影響。
　　7.分離大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，將LPS活化的巨噬細(xì)胞與大鼠肝前體細(xì)胞系進(jìn)行Transwell共培養(yǎng)，研究巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子對(duì)肝前體細(xì)胞自我更新的影響。
　　8.用含巨噬細(xì)胞上清的條件培養(yǎng)基對(duì)肝前體細(xì)胞系進(jìn)行長期刺激，通過體外克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察其對(duì)肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　9.分別用細(xì)胞因子TNF

8、-α、IL-6長期刺激肝前體細(xì)胞系，通過NOD-SCID鼠皮下荷瘤觀察TNF-α、IL-6是否引起肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　10.通過檢測(cè)TNF-α長期刺激的肝前體細(xì)胞的T-IC標(biāo)志物表達(dá)、克隆形成、成球能力等，研究TNF-α長期刺激是否使肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為T-IC。
　　11.利用慢病毒建立干擾TNFR1的肝前體細(xì)胞系，驗(yàn)證巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α對(duì)肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響。
　　12.通過核型分析，研究TNF-α

9、長期刺激的肝前體細(xì)胞是否具有染色體不穩(wěn)定性。
　　13.通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)中心體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)、RT-PCR檢測(cè)染色體不穩(wěn)定性關(guān)鍵調(diào)控分子的表達(dá)，研究TNF-α引起肝前體細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性的機(jī)制。
　　14.通過RT-PCR、western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)TNF-α長期刺激的肝前體細(xì)胞中干性調(diào)控基因和信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)。
　　15.通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證明p-STAT3對(duì)Nanog、Lin28啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)

10、合。
　　16.用STAT3抑制劑驗(yàn)證STAT3對(duì)TNF-α長期刺激的肝前體細(xì)胞自我更新的影響。
　　17.通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)調(diào)控STAT3的上游分子，并用Src抑制劑驗(yàn)證Src對(duì)STAT3的調(diào)控。
　　研究結(jié)果:
　　1.在CK19陽性的HCC中，OV6陽性比例為65％左右。
　　2.CK19+OV6+肝癌比CK19+OV6-肝癌具有更侵襲性的病理特征，并且病人術(shù)后更早復(fù)發(fā)。
　　

11、3.在大鼠DEN誘癌模型中，肝前體細(xì)胞隨著時(shí)間明顯擴(kuò)增;肝臟中T-IC標(biāo)志物的表達(dá)與炎性因子TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　4.從DEN大鼠第15周肝臟中分選的OV6陽性肝前體細(xì)胞能在NOD-SCID鼠皮下形成腫瘤，且腫瘤組織表達(dá)AFP、CK19。
　　5.與從DEN/saline組分選的肝前體細(xì)胞相比，DEN/GdCl3組分選的肝前體細(xì)胞的T-IC標(biāo)志物表達(dá)降低;干性調(diào)控基因和自我更新能力降低;DEN/GdCl3組腫瘤中未

12、檢測(cè)到OV6表達(dá)。
　　6.與巨噬細(xì)胞Transwell共培養(yǎng)促進(jìn)了肝前體細(xì)胞的自我更新能力;含巨噬細(xì)胞上清的條件培養(yǎng)基長期刺激肝前體細(xì)胞系，使肝前體細(xì)胞獲得了體外形成克隆的能力。
　　7.TNF-α長期刺激使肝前體細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并且形成的腫瘤表達(dá)AFP、CK19、OV6、CD133。IL-6長期刺激未引起肝前體細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
　　8.TNF-α長期刺激使肝前體細(xì)胞獲得了T-IC的特征，包括T-IC標(biāo)志物表達(dá)升高

13、、自我更新能力增強(qiáng)。
　　9.干擾TNFR1抑制了巨噬細(xì)胞上清刺激引起的肝前體細(xì)胞的惡性表型。
　　10.TNF-α長期刺激引起肝前體細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性。
　　11.UBD、Chk2異常表達(dá)參與了TNF-α引起的肝前體細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性。
　　12.STAT3的活化介導(dǎo)了TNF-α長期刺激引起的肝前體細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)。
　　13.Src參與了TNF-α長期刺激引起的STAT3的活化。
　　結(jié)論:

14、本研究將CK19和OV6聯(lián)合應(yīng)用作為肝癌的分子分型標(biāo)志物，提示肝前體細(xì)胞來源的HCC，并指導(dǎo)肝癌病人預(yù)后。利用體內(nèi)巨噬細(xì)胞清除模型和體外共培養(yǎng)模型證明了巨噬細(xì)胞在肝前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的促進(jìn)作用。巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α通過UBD、Chk2異常表達(dá)引起肝前體細(xì)胞發(fā)生染色體不穩(wěn)定性，以及通過Src/STAT3信號(hào)通路增強(qiáng)肝前體細(xì)胞自我更新能力，導(dǎo)致肝前體細(xì)胞向肝癌起始細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，為炎癥促進(jìn)肝癌發(fā)生提供新的思路。
　　第二部分Cyc

15、lin G1對(duì)肝癌起始細(xì)胞的調(diào)控及機(jī)制研究
　　研究背景和目的:原發(fā)性肝癌是一種惡性程度極高、預(yù)后極差的腫瘤，肝癌的5年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá)70％。由于大部分肝癌病人診斷時(shí)已處于晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，故只能采用化療或靶向治療。但是，由于肝癌具有化療抵抗的特征，常規(guī)化療或動(dòng)脈化療栓塞均不能完全殺死肝癌細(xì)胞。因此，闡明肝癌復(fù)發(fā)與化療抵抗的分子機(jī)制對(duì)提出新的治療策略具有重要作用。
　　近年來，越來越多的研究支持腫瘤干細(xì)胞理論，即腫瘤來源于一

16、小群具有自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能的腫瘤干細(xì)胞或腫瘤起始細(xì)胞。目前在多種腫瘤中均檢測(cè)到腫瘤起始細(xì)胞的存在，如白血病、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌等。肝癌起始細(xì)胞可以被特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物所鑒定，如CD133、CD90、EpCAM、CD24、OV6等。腫瘤起始細(xì)胞具有起始腫瘤和化療抵抗的特性。研究認(rèn)為肝癌起始細(xì)胞可能是目前治療效果差的最主要原因，清除肝癌起始細(xì)胞對(duì)肝癌長期消退甚至治愈十分關(guān)鍵。然而，目前肝癌起始細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚，缺乏特異

17、靶向肝癌起始細(xì)胞的治療。因此，闡明肝癌起始細(xì)胞擴(kuò)增的分子機(jī)制十分迫切。
　　Cyclin G1（細(xì)胞周期蛋白G1）是細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，與c-src具有同源性。研究報(bào)道Cyclin G1受p53轉(zhuǎn)錄激活并對(duì)p53家族蛋白產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)。在肝癌發(fā)生模型中，cyclin G1的缺失可導(dǎo)致腫瘤形成減少。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明cyclin G1能促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。然而，cyclin G1對(duì)肝癌起始細(xì)胞的調(diào)控及其在

18、肝癌化療抵抗、復(fù)發(fā)中的作用尚不清楚。
　　研究目的:探討cyclin G1對(duì)肝癌起始細(xì)胞的調(diào)控作用和分子機(jī)制，以及其在肝癌化療抵抗和復(fù)發(fā)中的臨床意義，為肝癌治療提供新的策略。
　　研究方法:
　　1.通過RT-PCR檢測(cè)化療抵抗的移植瘤中cyclin G1的表達(dá)情況。
　　2.采用AnnexinⅤ凋亡檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)過表達(dá)cyclin G1的肝癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞對(duì)sorafenib引起凋亡的反應(yīng)。
　　3.將

19、含138例肝癌病人的組織芯片進(jìn)行cyclin G1的免疫組織化學(xué)染色，結(jié)合病人隨訪信息分析cyclin G1與病人術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性;多因素分析評(píng)判cyclin G1作為術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素的可能性。
　　4.分離病人原代肝癌細(xì)胞進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)，比較貼壁原代肝癌細(xì)胞與sphere中cyclinG1的表達(dá)水平。
　　5.在從sphere中分選的CD133+或OV6+的肝癌起始細(xì)胞與陰性細(xì)胞中檢測(cè)cyclinG1的表達(dá)水平。

20、>　　6.通過RT-PCR檢測(cè)30例肝癌病人原代sphere中cyclin G1、CD133、CD90的表達(dá)情況，并對(duì)cyclin G1和CD133或CD90的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　7.比較過表達(dá)cyclin G1的肝癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中CD133、CD90的表達(dá)水平和形成sphere的能力。
　　8.通過體外和體內(nèi)有限稀釋實(shí)驗(yàn)，比較過表達(dá)cyclin G1的肝癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中肝癌起始細(xì)胞的比例。
　　9.通過RT

21、-PCR比較過表達(dá)cyclin G1的肝癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中干性相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　10.通過RT-PCR檢測(cè)肝癌病人原代sphere中cyclin G1和Sox2的表達(dá)情況，并對(duì)cyclin G1和Sox2的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　11.利用siRNA干擾Sox2表達(dá)，分析其對(duì)cyclin G1促進(jìn)肝癌起始細(xì)胞擴(kuò)增的影響。
　　12.將Akt、mTOR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)其對(duì)cyclin G1促進(jìn)Sox2表達(dá)和

22、成球能力的影響。
　　13.將Akt、mTOR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)其對(duì)cyclin G1過表達(dá)抵抗sorafenib引起的凋亡的影響。
　　14.將Akt、mTOR抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)其對(duì)cyclin G1促進(jìn)腫瘤起始的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.與對(duì)照相比，在化療抵抗的移植瘤中cyclin G1的表達(dá)升高。
　　2.過表達(dá)cyclin G1使肝癌細(xì)胞對(duì)sorafenib引起的凋亡不敏感。
　　3

23、.Cyclin G1高表達(dá)組病人術(shù)后復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)組，且cyclin G1可以作為判斷復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。
　　4.病人原代sphere中cyclin G1的表達(dá)水平高于貼壁細(xì)胞。
　　5.在從sphere中分選的CD133+或OV6+的肝癌起始細(xì)胞中，cyclin G1的表達(dá)水平高于CD133-或OV6-細(xì)胞。
　　6.與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)cyclin G1的肝癌細(xì)胞中CD133、CD90的表達(dá)升高，且成球能力增

24、強(qiáng)。
　　7.與對(duì)照細(xì)胞相比，過表達(dá)cyclin G1的肝癌細(xì)胞中肝癌起始細(xì)胞的比例增多。
　　8.過表達(dá)cyclin G1促進(jìn)干性調(diào)控基因Sox2表達(dá)升高。
　　9.敲低Sox2表達(dá)抑制了cyclin G1促進(jìn)的肝癌起始細(xì)胞擴(kuò)增。
　　10.Akt/mTOR抑制劑抑制了cyclin G1對(duì)Sox2表達(dá)和成球能力的促進(jìn)作用。
　　11.Akt/mTOR抑制劑抑制了cyclin G1過表達(dá)對(duì)sorafenib