永生化肝前體細胞株的構建及維甲酸在肝前體細胞分化中的作用研究.pdf

1、肝臟疾病最終常常發(fā)生功能的紊亂和臟器的衰竭。肝移植為肝臟疾病的治療提供了無限前景。但供體肝源不足、排斥反應及長期免疫抑制劑的治療限制了肝移植的發(fā)展。肝干細胞移植成為一種有潛力的替代治療方法。同時對肝干細胞增殖、分化的研究還有助于了解肝臟的發(fā)生、發(fā)育機制，為進一步研究肝癌的發(fā)病機制及治療提供基礎。近年來，隨著分子生物學、細胞生物學、細胞培養(yǎng)技術及免疫學的發(fā)展，肝干細胞的分離鑒定和培養(yǎng)取得了一些進展。但如何分離、篩選獲得高純度、高特異性的肝

2、干細胞，如何建立肝干細胞穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，如何調節(jié)肝干細胞特異分化，仍是急需解決的問題。 在該課題的第一部分中，我們首先制備了含LoxP位點特異修飾的SV40大T抗原基因的SSR＃69逆轉錄病毒液，并感染從孕14.5d的胎鼠肝臟中分離出的肝細胞（此時的肝細胞被認為大部分為肝前體細胞），使其永生化。再用有限稀釋法培養(yǎng)獲得單克隆永生化細胞株，并進一步篩選鑒定。首先取不同階段的肝組織：孕12.5d、14.5d、16.5d、18.5d

3、及出生后1d、7d、14d、28d，利用real time PCR觀察常見的早期指標和晚期指標的表達趨勢。結果發(fā)現(xiàn)其早期標志基因CD34、Pou5f1隨組織的發(fā)育成熟逐漸降低；AFP早期逐漸上升，至出生前達到最高，出生后開始迅速降低；DLK早期逐漸上升，至16.5d達到最高，后逐漸降低。晚期標志基因A1b、CK18、TAT、ApoB隨組織的發(fā)育成熟逐漸上升，TAT上升較晚，約出生后第二周開始。在此基礎上我們以相同方法獲得的出生后14d的

4、永生化肝細胞株LC14d及肝腫瘤細胞株Hepal-6為對照，篩選出高表達早期標志基因的單克隆細胞株5個，并進一步通過形態(tài)學觀察、地塞米松和二甲亞楓誘導分化等進行鑒定。結果顯示篩選獲得的單克隆細胞株細胞增殖旺盛、成集落樣生長，體積較小、多邊形、核漿比例高。經(jīng)誘導分化后，ICG攝取試驗證實篩選出的單克隆細胞株可誘導分化為成熟的肝細胞，為具有分化潛能的肝前體細胞。連續(xù)傳代50代后檢測細胞無明顯差異。第二步我們檢測導入的外源基因SV40大T抗原

5、是否可逆。首先我們用western blot檢測證實獲得的永生化肝前體細胞株有大T抗原的表達，說明SV40大T抗原的導入成功。而加入腺病毒Ad-Cre處理后，細胞無大T抗原的表達，說明在Cre重組酶的作用下，大T抗原可以被敲除。而經(jīng)腺病毒Ad-Cre處理的單克隆細胞株生長曲線降低，白蛋白熒光素酶報告質粒檢測顯示白蛋白表達上升，即分化增加。也證實SV40大T抗原可促進細胞的增殖，抑制細胞的分化，而Cre重組酶可敲除LoxP位點特異修飾的S

6、V40大T抗原基因。第三步體內成瘤實驗。我們于皮下注入熒光素酶標記的永生化肝前體細胞株，對側注入同樣標記的經(jīng)Cre重組酶處理的永生化肝前體細胞株，并以肝癌細胞株為對照，活組織成像隨訪。結果顯示隨著時間的延長，植入細胞熒光素酶的表達降低，說明皮下存活的細胞數(shù)減少。與肝癌細胞株相比，皮下植入永生化肝前體細胞株熒光素酶的表達在10天內基本消失，沒有成瘤的趨勢。而經(jīng)Cre重組酶處理后的永生化肝前體細胞株，熒光素酶的表達消失提前，說明細胞增殖降低

7、，存活時間縮短。這同樣也說明導入的大T抗原可以被敲除，是可逆的。因此，在第一部分實驗中，我們獲得了可逆的永生化的肝前體細胞株，為我們第二部分的實驗打下良好的基礎。 在該課題的第二部分中，我們檢測了維甲酸（Retinoic acid，RA）對肝前體細胞分化的影響。維甲酸是維生素A的體內衍生物。和其它類視黃醇一樣，它在脊椎動物的胚胎發(fā)育、內環(huán)境的穩(wěn)定及細胞的增殖分化中都發(fā)揮著重要作用。但維甲酸在組織特異性前體細胞分化中的作用報道卻很

8、少。因此，本課題在第一部分構建永生化肝前體細胞株的前提下，進一步研究了維甲酸對胎肝前體細胞分化的影響，以期獲得一種誘導肝前體細胞分化的新方法，并進一步研究維甲酸誘導肝前體細胞分化的機制。而維甲酸可誘導與肝臟具有共同起源的胰腺祖細胞的增殖和進一步分化為β細胞，也提示維甲酸可能在肝臟的發(fā)育中有重要作用。 在該部分研究中我們首先檢測了不同階段的肝組織中內源性維甲酸合成代謝相關基因及維甲酸受體和輔助因子的表達水平。結果顯示維甲酸受體RA

9、Rα、RXRα和RXRγ在所有樣品中均有表達；而RARβ和RXRβ在出生前表達較低而出生后逐漸升高；RARγ在出生前無表達，出生后逐漸上升。維甲酸合成酶Raldh1和Raldh2在所有組織中均有表達，Raldh3在出生前表達很低，出生后穩(wěn)定表達。核受體共抑制劑在所有樣品中均高表達，而共激動劑在出生前逐漸降低，出生后逐漸上升。提示維甲酸信號系統(tǒng)可能和肝前體細胞的分化密切相關。我們進一步利用白蛋白熒光素酶報告質粒篩選獲得了全反式維甲酸和9-

10、順式維甲酸最適藥物濃度，通過最適藥物濃度的全反式維甲酸和9-順式維甲酸誘導，RT-PCR檢測可見其早期標志基因表達降低，晚期標志基因表達上升，免疫熒光檢測得出一致的結論。糖原沉積試驗結果顯示誘導后糖原沉積增加。以上結果說明全反式維甲酸和9-順式維甲酸能促進肝前體細胞向前肝細胞的分化。為進一步了解參與該途徑的維甲酸受體，我們構建了腺病毒RARa和RXRα，感染細胞后通過白蛋白熒光素酶報告質粒檢測其分化的改變。結果顯示感染腺病毒RARα或R