microRNA在TNF-α誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡中作用及機制的研究.pdf

1、研究目的：(1)建立原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)體外培養(yǎng)方法并探討TNF-α對HUVEC凋亡程度的影響,篩選出TNF-α誘導凋亡的最佳作用濃度和時間;(2)探討TNF-α誘導凋亡的HUVECmicroRNA的差異表達譜,驗證在TNF-α誘導HUVEC凋亡中顯著差異表達的microRNA;(3)根據(jù)篩選結(jié)果,探討microRNA-23a在HUVEC凋亡中的調(diào)節(jié)功能。(4)研究microRNA-23a在TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中的

2、作用機制,為對抗內(nèi)皮細胞凋亡的治療途徑提供理論和實驗依據(jù)。
　　 研究方法：實驗分為四個部分：(1)原代細胞培養(yǎng)參照文獻報道方法并加以改進,通過形態(tài)學觀察和免疫細胞化學法對細胞進行鑒定;然后用不同濃度TNF-α(0、1ng/ml、10ng/ml、40ng/ml、100ng/ml)處理內(nèi)皮細胞不同時間(0、12h、24h、48h),通過電鏡,Hoechst33258熒光染色,TUNEL法,實時熒光定量PCR及western blo

3、t檢測HUVEC的凋亡程度,確定TNF-α能夠誘導內(nèi)皮細胞凋亡的最佳作用濃度和時間;(2)采用laParafloTM microRNA芯片技術(shù),將4例空白對照標本與4例TNF-α(10ng/ml,24h)誘導凋亡的HUVEC標本的microRNA進行比對,根據(jù)統(tǒng)計學的有關(guān)方法分析芯片實驗數(shù)據(jù),篩選出共同差異表達的候選microRNA;并采用熒光實時定量PCR的方法,分別驗證這些候選microRNA的差異表達情況。將芯片和熒光實時定量PC

4、R兩種方法結(jié)論一致的候選microRNA確定為有意義的共同差異表達microRNA;(3)采用microRNA-23a抑制劑(LNA-anti-miR-23a,50nmol/L)和microRNA-23a前體(Pre-miR-23a,50nmol/L)瞬時轉(zhuǎn)染HUVEC使內(nèi)皮細胞抑制或過表達microRNA-23a,設(shè)立空白對照組,用實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。隨后用TNF-α干預轉(zhuǎn)染后的HUVEC,通過Hoechst33258熒

5、光染色,TUNEL染色,實時熒光定量PCR及western blot等方法檢測不同轉(zhuǎn)染組與對照組HUVEC的凋亡程度改變;(4)使用miRanda,picTar和Targetscan軟件分析,結(jié)合文獻查詢和基因芯片研究結(jié)果,預測與凋亡相關(guān)的microRNA-23a的靶基因;用microRNA抑制劑轉(zhuǎn)染HUVEC使microRNA-23a表達水平下調(diào),并采用實時熒光定量PCR法和Western blot法觀察其是否引起靶基因表達增多。

6、r>　　 研究結(jié)果：(1)經(jīng)相差顯微鏡觀察以及Ⅷ因子染色證實培養(yǎng)的細胞(97.5％)為HUVEC,臺盼藍染色顯示95％以上細胞存活良好;TNF-α呈濃度依賴性和時間依賴性引起HUVEC凋亡;(2)TNF-α(10 ng/ml)處理HUVEC24h后,芯片結(jié)果示microRNA表達譜有明顯變化,其中有12個microRNA表達上調(diào),9個microRNA表達下調(diào);實時熒光定量PCR結(jié)果證實miRNA-23a,miRNA-126表達顯著減少

7、;(3)Hoechst33258熒光染色,TUNEL染色,實時熒光定量PCR及western blot結(jié)果顯示：microRNA-23a抑制劑使TNF-α誘導的HUVEC凋亡數(shù)量明顯增多;microRNA-23a過表達使得TNF-α誘導的HUVEC凋亡數(shù)量明顯減少。(4)經(jīng)過生物信息學分析預測APAF-1,caspase-7和STK4可能是microR-23a的3個候選靶基因,并通過實時熒光定量PCR和Western blot證實mic

8、roRNA-23a抑制劑組該3個靶基因的表達有顯著性升高。
　　 研究結(jié)論：(1)本研究在成功建立HUVEC體外培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上,建立了TNF-α誘導HUVEC凋亡的模型,確立TNF-α能夠誘導內(nèi)皮細胞凋亡的最佳作用濃度為10ng/ml,時間為24h;(2)運用microRNA芯片技術(shù),首次發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導凋亡的內(nèi)皮細胞中microRNA-23a表達明顯減少,microRNA-126表達也有明顯下調(diào)。這為進一步研究microR