骨橋蛋白促進(jìn)肝干細(xì)胞-肝前體細(xì)胞增殖和遷移的研究.pdf

1、當(dāng)肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷，尤其是在肝細(xì)胞的增殖受到抑制的時(shí)候，會(huì)產(chǎn)生一種被稱(chēng)作“卵圓細(xì)胞”的肝干細(xì)胞/肝前體細(xì)胞，依賴(lài)卵圓細(xì)胞完成對(duì)肝臟的修復(fù)和肝再生過(guò)程。這些細(xì)胞之所以被稱(chēng)作是肝干細(xì)胞/肝前體細(xì)胞，是由于它們既表達(dá)肝細(xì)胞的標(biāo)記物（Alb和AFP）又表達(dá)膽管細(xì)胞的標(biāo)記物(CK19)，并且有分化成肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的潛能。
　　 骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，也被稱(chēng)作早期T淋巴細(xì)胞激活基因1，是一種磷酸化的糖蛋白。它廣泛

2、參與機(jī)體的多種生理和病理過(guò)程，包括保護(hù)細(xì)胞與抑制細(xì)胞凋亡;調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及炎癥細(xì)胞的趨化，如巨噬細(xì)胞的募集;改善損傷組織的重構(gòu)與修復(fù);OPN的高表達(dá)還能促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，如乳腺癌和肝癌的惡化。OPN的高表達(dá)和各類(lèi)疾病的預(yù)后有顯著的相關(guān)性。在腫瘤惡化方面， OPN已成為一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物。OPN在一些有膽管細(xì)胞增殖的肝臟疾病中表達(dá)上調(diào)，例如非酒精性脂肪肝炎、爆發(fā)性肝炎和膽道閉鎖。然而，它在肝前體細(xì)胞中的作用還不清楚。
　　

3、 為了更好的研究卵圓細(xì)胞，我們利用一個(gè)穩(wěn)定的卵圓細(xì)胞增殖模型—膽堿缺乏飼料并補(bǔ)充乙硫氨酸(choline-deficient，ethionine-supplemented diet，CDE)。這個(gè)模型是誘導(dǎo)大鼠肝臟產(chǎn)生卵圓細(xì)胞的經(jīng)典模型之一。
　　 野生型(wild type，WT)小鼠隨機(jī)分成兩組，分別喂食2周的正常飼料(controldiet)和50％ CDE飼料。通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間50％ CDE處理的小鼠肝臟中OPN的mRN

4、A表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)在CDE誘導(dǎo)卵圓細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)程中，肝臟中的OPN表達(dá)逐漸增加。但是在這種模型中，OPN表達(dá)增加發(fā)生在何種類(lèi)型的細(xì)胞以及在這些細(xì)胞中發(fā)揮什么樣的作用尚不明確。我們通過(guò)免疫組化以及免疫熒光共染技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OPN只在卵圓細(xì)胞中高表達(dá)，沒(méi)有明顯的證據(jù)表明其它類(lèi)型的細(xì)胞也高表達(dá)OPN。為了研究OPN在卵圓細(xì)胞中的作用，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中引入了OPN基因敲除小鼠(OPN gene knockout mouse，OPN-KO)。WT和O

5、PN-KO小鼠分別喂食2周的50％ CDE飼料，PanK和EpCAM免疫熒光結(jié)果顯示，OPN-KO小鼠中的卵圓細(xì)胞數(shù)量明顯少于WT小鼠。PCNA染色、BrdU增殖實(shí)驗(yàn)、四甲基偶氮唑鹽改良實(shí)驗(yàn)(MTS)以及克隆形成等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPN能夠促進(jìn)卵圓細(xì)胞的增殖能力和自我更新能力;此外，我們通過(guò)細(xì)胞標(biāo)記保留實(shí)驗(yàn)比較WT和OPN-KO中的肝干細(xì)胞庫(kù)，結(jié)果顯示，OPN可能通過(guò)影響肝干細(xì)胞庫(kù)，尤其是膽管細(xì)胞和膽管周?chē)母渭?xì)胞的數(shù)量，從而影響卵圓細(xì)胞

6、的產(chǎn)生。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、免疫熒光、WesternBlotting、抗體阻斷、RNA干擾抑制OPN表達(dá)以及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OPN能夠促進(jìn)卵圓細(xì)胞的遷移能力并賦予卵圓細(xì)胞間質(zhì)樣的特性。抗體阻斷實(shí)驗(yàn)以及添加條件培養(yǎng)上清和重組蛋白的實(shí)驗(yàn)顯示，分泌型OPN在卵圓細(xì)胞增殖和遷移的過(guò)程中發(fā)揮很重要的作用。最后，通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)50％ CDE誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤為混合型的腫瘤(combined hepatocellular carcinom

7、a and cholangiocarcin-oma，cHCC-CC)并且表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)記物——EpCAM，說(shuō)明該種類(lèi)型的腫瘤可能起源于肝干細(xì)胞/肝前體細(xì)胞。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，OPN可能通過(guò)促進(jìn)β-Catenin信號(hào)通路的激活使得卵圓細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對(duì)77例人肝癌臨床病例的研究發(fā)現(xiàn)，OPN的高表達(dá)與β-Catenin在胞漿/胞核中的表達(dá)成正相關(guān)。
　　 本課題闡明了在50％ CDE模型中，增殖的卵圓細(xì)胞高表達(dá)OPN;

8、 OPN有利于肝干細(xì)胞庫(kù)的維持;分泌型OPN能夠促進(jìn)卵圓細(xì)胞的增殖和遷移能力;OPN可能通過(guò)Src降低E-cadherin的表達(dá)，釋放游離的β-Catenin入胞漿，通過(guò)激活β-Catenin信號(hào)通路影響了卵圓細(xì)胞的增殖和后期的腫瘤發(fā)生。
　　 肝干細(xì)胞參與肝臟的多種病理過(guò)程。隨著研究的不斷深入，針對(duì)肝干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物、調(diào)控肝干細(xì)胞的細(xì)胞因子以及信號(hào)分子等關(guān)鍵因素必將得到闡明，這對(duì)研究肝臟的發(fā)育，以及針對(duì)肝干細(xì)胞的診斷和治療