ALX1誘導EMT促進肺癌侵襲和遷移的機制以及β-欖香烯的逆轉作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 ALX1在肺癌中的表達研究
　　目的:比較ALX1在肺癌組織中表達差異情況，揭示ALX1表達水平與肺癌惡性程度以及預后的關系。
　　方法:通過Real time-PCR實驗考察47例肺癌組織和癌旁組織樣本中ALX1mRNA的表達水平;利用免疫組織化學實驗考察發(fā)生淋巴結轉移的肺癌組織和未轉移的肺癌組織中ALX1蛋白的表達水平;利用Kaplan-Meier生存分析研究ALX1

2、的表達水平與肺癌病人的預后情況。
　　結果:1.47例肺癌組織均表達ALX1，且顯著高于癌旁組織樣本中ALX1 mRNA的表達水平。2.47例肺癌組織中，發(fā)生淋巴結轉移的肺癌組織的ALX1 mRNA的表達水平顯著高于未轉移的肺癌組織。3.免疫組化分析顯示，發(fā)生淋巴結轉移的肺癌組織中ALX1陽性細胞比例要顯著高于未轉移的肺癌組織中ALX1陽性細胞的比例。4.ALX1表達水平較低的肺癌患者的生存期顯著長于ALX1高表達組。
　　

3、結論:ALX1在肺癌組織中特異性高表達，發(fā)生淋巴結轉移的肺癌組織中表達水平更高。ALX1高表達縮短肺癌患者的生存期。
　　第二部分 構建ALX1過表達和基因沉默細胞系
　　目的:構建ALX1穩(wěn)定轉染和基因沉默的細胞模型，為ALX1調(diào)控肺癌細胞侵襲和遷移的分子機制研究提供工具。
　　方法:通過Real time-PCR實驗考察8種肺癌細胞系中ALX1 mRNA的表達水平。應用逆轉錄病毒轉導構建過表達人ALX1的H1975

4、細胞模型，應用shRNA技術沉默H460細胞中ALX1的表達。通過Western blot實驗驗證模型構建情況，采用MTT實驗觀察構建細胞模型的增殖能力，并觀察模型細胞的形態(tài)變化。通過Western blot實驗和免疫熒光實驗考察ALX1誘導肺癌細胞EMT情況。
　　結果:1.8種肺癌細胞系中ALX1表達水平各異，H1975細胞表達較低，而H460細胞表達較高，適用于細胞轉染研究。2.成功構建了ALX1-pBabe-H1975細胞

5、模型和ALX1-siRNA-H460細胞模型，Western blot實驗顯示過表達ALX1后，H1975細胞ALX1蛋白表達水平顯著高于mock-H1975和pBabe-H1975細胞;三組ALX1siRNA轉染細胞中，ALX1蛋白表達水平顯著低于對照細胞。3.MTT結果表明，過表達ALX1后，ALX1-pBabe-H1975細胞的增殖顯著快于對照細胞;沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細胞的增殖能力下降。4.過表達ALX

6、1后，ALX1-pBabe-H1975細胞呈現(xiàn)間質(zhì)細胞樣改變;沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細胞呈現(xiàn)上皮樣細胞形態(tài)。5.過表達ALX1后，ALX1-pBabe-H1975細胞上皮細胞標志蛋白E-cadherin和α-catenin表達降低，間質(zhì)細胞標志蛋白Vimentin和N-cadherin表達上調(diào);沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細胞E-cadherin和α-catenin表達上調(diào)，而Vimentin和

7、N-cadherin表達降低。免疫熒光實驗結果與Western blot實驗結果一致。
　　結論:成功構建了ALX1-pBabe-H1975和ALX1-siRNA-H460細胞模型，并成功運用于ALX1誘導肺癌細胞EMT的研究。
　　第三部分 ALX1誘導肺癌細胞EMT的機制研究
　　目的:分析ALX1誘導肺癌細胞EMT的分子機制，揭示ALX1誘導EMT對肺癌細胞侵襲和遷移的影響。
　　方法:利用構建的ALX1高

8、表達和基因沉默細胞模型，通過Transwell和基質(zhì)膠侵襲實驗、Real time-PCR實驗、Western blot實驗和熒光素酶實驗考察ALX1誘導肺癌細胞EMT的分子機制。
　　結果:1.過表達ALX1增加ALX1-pBabe-H1975細胞通過Transwell膜和基質(zhì)膠的數(shù)量，侵襲和遷移能力增強。沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細胞侵襲和遷移能力減弱。2.過表達ALX1不影響ALX1-pBabe-H197

9、5細胞中ZEB1、Slug和Twist的mRNA和蛋白表達，顯著提高Snail的mRNA和蛋白表達水平。沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細胞Snail的mRNA和蛋白表達水平顯著下調(diào)。3.過表達ALX1顯著提高H1975細胞中熒光素的強度。沉默ALX1后，ALX1-siRNA-H460細胞熒光素強度顯著下降。4.沉默Snail后，ALX1-pB abe-H1975細胞中低水平的E-cadherin和α-catenin表達恢

10、復，而高水平的Vimentin和N-cadherin表達下降;穿透基質(zhì)膠和Transwell膜的細胞個數(shù)減少。
　　結論:ALX1通過Snail誘導肺癌細胞EMT，增強肺癌細胞的侵襲和遷移能力。這些發(fā)現(xiàn)為ALX1作為潛在治療靶點的進一步研究奠定了基礎。
　　第四部分 β-欖香烯逆轉ALX1誘導肺癌細胞EMT的機制研究
　　目的:考察β-欖香烯對ALX1誘導的EMT的影響，揭示β-欖香烯逆轉肺癌EMT的分子機制。

11、　　方法:利用構建的ALX1高表達細胞模型，通過MTT、Transwell侵襲、Transwell遷移實驗和Western blot實驗、免疫熒光實驗考察β-欖香烯對ALX1誘導肺癌細胞EMT的影響和機制。
　　結果:1.β-欖香烯處理后，ALX1過表達的ALX1-pBabe-H1975細胞形態(tài)呈現(xiàn)上皮樣改變，增殖速度減慢。2.β-欖香烯處理后，通過Transwell膜和基質(zhì)膠的ALX1-pBabe-H1975細胞數(shù)量減少，ALX

12、1-pBabe-H1975細胞侵襲和遷移能力減弱。3.Western blot實驗表明β-欖香烯上調(diào)ALX1過表達的ALX1-pBabe-H1975細胞的E-cadherin和α-catenin，下調(diào)Vimentin和N-cadherin。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)E-cadherin熒光強度增強，而N-cadherin強度減弱。4.β-欖香烯降低ALX1-pBabe-H1975細胞Snail的蛋白水平。
　　結論:β-欖香烯抑制Snail