β-欖香烯抑制HepG2細(xì)胞侵襲及遷移的作用機(jī)制研究.pdf

1、肝癌（HCC）是全球最常見的，死亡率最高的惡性腫瘤之一，每年有100萬例新確診的病例。目前，肝癌手術(shù)切除仍然是治療肝癌最有效的方法，但是僅對(duì)早期確診的患者有效。術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是患者不能長期生存的主要原因，而肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移又是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，因此尋求有效的治療肝癌轉(zhuǎn)移的方法來提高患者的生存率及改善患者的生存質(zhì)量變得十分重要。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，蛋白水解酶對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的降解在這個(gè)過程中起著至關(guān)重要

2、的作用。MMPs是一類主要的蛋白水解酶，與降解細(xì)胞外基質(zhì)以及惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。MMP-9是MMPs家族中重要的一員，在多種腫瘤中，它均可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，活化的NF-κB入核與DNA結(jié)合，引起多種與腫瘤生長和進(jìn)展有關(guān)的分子的活化與表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤中NF-κB活化可以促進(jìn)MMP-9的表達(dá)及分泌，抑制NF-κB的活化能夠下調(diào)MMP-9的表達(dá)及分泌，從而抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。
　　β-欖香烯是從姜

3、科姜黃屬植物溫莪術(shù)中提取的倍半萜烯類化合物，它是我國自行研發(fā)的國家二類抗腫瘤新藥，具有抗瘤譜廣泛，療效確切，毒副作用輕微等突出優(yōu)點(diǎn)。有研究表明β-欖香烯可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、干預(yù)腫瘤細(xì)胞分化，抗氧化等作用機(jī)制來抑制肝癌生長，但是對(duì)于其抑制肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究較少。我們的研究目的在于探討β-欖香烯是否可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲及遷移以及它是否可以通過抑制NF-κB介導(dǎo)的MMP-9的分泌及表達(dá)來發(fā)揮其抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用，為

4、尋找有效的抗肝癌轉(zhuǎn)移藥物和治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　1.探討β-欖香烯對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響，篩選出低細(xì)胞毒性的β-欖香烯用于接下來的實(shí)驗(yàn)，以排除增殖抑制對(duì)細(xì)胞黏附、遷移以及侵襲實(shí)驗(yàn)的影響。
　　2.探討β-欖香烯是否通過抑制肝癌HepG2細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位來下調(diào)MMP-9的酶活性及蛋白表達(dá)，發(fā)揮其抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。
　　方法：
　　1. MTT法觀察β-欖香烯對(duì)肝癌細(xì)胞增殖

5、活性的影響。
　　取對(duì)數(shù)生長期的肝癌HepG2細(xì)胞，分別給予每組細(xì)胞0、12.5、25、50、100、200、400μg/mlβ-欖香烯，培養(yǎng)24h后，MTT法檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活性。
　　2.β-欖香烯對(duì)HepG2細(xì)胞黏附、侵襲及遷移能力的影響。
　　以0、12.5、25μg/mlβ-欖香烯作用于HepG2細(xì)胞，通過細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)觀察β-欖香烯對(duì)HepG2細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)定性研究β-欖香烯

6、對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響；在此基礎(chǔ)之上，利用Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，定量觀察β-欖香烯對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。
　　3.β-欖香烯抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制
　　通過明膠酶譜法及Western Blot觀察不同濃度β-欖香烯對(duì)于MMP-9酶活性及蛋白表達(dá)的影響；通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)及Western Blot觀察不同濃度β-欖香烯對(duì)于NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響；通過使用NF-κB核轉(zhuǎn)位特異性抑制劑DHMEQ觀察是否可以通

7、過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位來抑制MMP-9的分泌及表達(dá)，從而進(jìn)一步闡明β-欖香烯抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1. MTT法顯示：
　　高濃度的β-欖香烯(≥50μg/ml）可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，在分別給予各組細(xì)胞50、100、200、400μg/mlβ-欖香烯后，細(xì)胞的存活率分別是（88.93±3.05％， P<0.05），（68.06±2.79%，P<0.05），（40.77±0.73%，

8、P<0.05），（36.97±0.81%，P<0.05），其存活率呈現(xiàn)的是一個(gè)逐漸遞減的趨勢。低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）不能明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，所以取β-欖香烯濃度為12.5μg/ml，25μg/ml用于接下來的實(shí)驗(yàn)以排除增殖抑制對(duì)于實(shí)驗(yàn)的影響。
　　2.β-欖香烯對(duì)HepG2細(xì)胞黏附、侵襲及遷移能力的實(shí)驗(yàn)研究表明：
　　細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）可以抑制細(xì)胞

9、與基質(zhì)之間的黏附能力，在分別給予各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞的黏附率分別是（71.02±2.92%，P<0.05），（47.32±0.91%， P<0.05），各組細(xì)胞的黏附率呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低濃度的β-欖香烯可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力，在給予各組細(xì)胞0、12.5、25μg/ml的β-欖香烯后，劃痕的愈合率分別為（65.82±2.12%，P<0.

10、05），（40.24±0.91%，P<0.05），（31.22±1.72%，P<0.05），各組細(xì)胞的遷移率呈現(xiàn)出的是一個(gè)遞減的趨勢。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)表明：低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）可以抑制細(xì)胞的遷移能力，在分別給予各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞的遷移率分別為（53.57±2.31%，P<0.05），（17.86±1.81%，P<0.05），其遷移率呈

11、現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明：低濃度的β-欖香烯可以抑制細(xì)胞的侵襲能力，在分別給予各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞的侵襲率分別為（50.03±3.51%，P<0.05），（31.25±2.37%，P<0.05），各組細(xì)胞的侵襲率呈現(xiàn)出逐漸遞減的趨勢。
　　3.β-欖香烯對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)表明：
　　（1）明膠酶譜法表明：β-欖香烯可

12、以抑制HepG2細(xì)胞MMP-9的酶活性，在分別給予各組細(xì)胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，MMP-9的酶活性分別是對(duì)照組的0.31倍（P<0.05），0.08倍（P<0.05）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明：β-欖香烯可以抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，與對(duì)照組相比，在給予各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后， NF-κB的核轉(zhuǎn)位能力呈現(xiàn)的是遞減的趨勢。Western Blot表明，β-欖香烯可以降低細(xì)胞的MMP-

13、9及細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB蛋白的表達(dá)，同時(shí)還可以增加細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)。在分別給予各組細(xì)胞12.5μg/ml、25μg/ml的β-欖香烯后，MMP-9的蛋白的表達(dá)分別是空白對(duì)照組的0.79倍（P<0.05），0.53倍（P<0.05）；細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)分別是空白對(duì)照組的0.65倍（P<0.05），0.53倍（P<0.05）；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)分別是空白對(duì)照組的2.20倍（P<0.05），6.12倍（P<0.

14、05）。
　　（2）在給予HepG2細(xì)胞20μg/ml的NF-κB核轉(zhuǎn)位特異性抑制劑DHMEQ后，通過明膠酶譜法及Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，MMP-9的酶活性及蛋白表達(dá)均明顯下降（P<0.05）
　　結(jié)論：
　　1.高濃度的β-欖香烯（≥50μg/ml）具有抑制HepG2細(xì)胞增殖的能力。
　　2.低濃度的β-欖香烯（≤25μg/ml）具有抑制HepG2細(xì)胞黏附，侵襲及遷移的能力。