EGFL7誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、背景:
　　胃癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最新數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤前列，導(dǎo)致了重大的公共健康負(fù)擔(dān)。雖然對(duì)胃癌的治療取得了顯著的進(jìn)步，使患者的總體生存期得以提高，但是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移使胃癌患者的五年生存率仍然很低。而且大多數(shù)新診斷的胃癌患者已表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性疾病，這使得對(duì)胃癌的治療仍然是腫瘤學(xué)中的重要難題之一。
　　近年來(lái)發(fā)現(xiàn):表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7(Epidermal growthfactor-like domain-

2、containing protein7，EGFL7)可明顯增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力，是重要的運(yùn)動(dòng)刺激因子和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子。早期研究表明，EGFL7是一種內(nèi)皮細(xì)胞源性的調(diào)節(jié)血管形成的分泌因子。最近的研究報(bào)道顯示，EGFL7在多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，包括腎癌，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤，肝癌和結(jié)腸癌。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃癌組織中也有EGFL7的表達(dá)，而且其表達(dá)與病理組織分化程度、臨床進(jìn)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。因此，EGFL7可能作為預(yù)測(cè)癌

3、癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的新分子標(biāo)記。然而它在胃癌中的具體作用機(jī)制目前尚不清楚，有必要進(jìn)行下一步深入研究。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其中極化上皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞觸發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是轉(zhuǎn)移過(guò)程中間重要的環(huán)節(jié)。EMT賦予細(xì)胞間充質(zhì)表型從而增加細(xì)胞的侵襲和遷移能力，啟動(dòng)轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)。已有研究表明，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)EMT的活化促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移

4、。與EGF有相似之處，EGFL7包含2個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域。然而，EGFL7是否通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域或者其中一個(gè)結(jié)構(gòu)域來(lái)調(diào)控EMT，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移仍有待確定。此外，EGFL7在胃癌(gastric cancer, GC)中通過(guò)EMT調(diào)節(jié)的分子機(jī)制仍是未知的，目前未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的:
　　1、研究沉默EGFL7基因?qū)ξ赴┘?xì)胞BGC823的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　2、研究EGFL7過(guò)表達(dá)及缺失相關(guān)結(jié)構(gòu)域?qū)ξ赴?/p>

5、細(xì)胞MKN28侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　3、探究EGFL7誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　方法:
　　1、研究沉默EGFL7基因?qū)ξ赴┘?xì)胞BGC823侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響
　　(1)運(yùn)用Western-blotting和Real-Time PCR檢測(cè)EGFL7在胃癌細(xì)胞株（BGC823、SGC7901、MKN28和MKN45）和胃黏膜正常細(xì)胞株GES-1中的表達(dá)，篩選出EGFL7高

6、表達(dá)胃癌細(xì)胞株。
　　(2)構(gòu)建EGFL7干擾質(zhì)粒載體(pGPU6/GFP/Neo-EGFL7-shRNA)及陰性對(duì)照質(zhì)粒載體(pGPU6/GFP/Neo-nonspecific-shRNA);建立EGFL7基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　(3)通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)比較各實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。
　　(4)運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的情況。
　　(5)使用流式細(xì)胞術(shù)

7、檢測(cè)腫瘤細(xì)胞失巢凋亡的情況。
　　(6)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):觀察裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)情況;解剖裸鼠并切取移植瘤，觀察腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，制作HE切片觀察腫瘤的病理形態(tài)特征。
　　2、研究EGFL7過(guò)表達(dá)及缺失相關(guān)結(jié)構(gòu)域?qū)ξ赴┘?xì)胞MKN28侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響
　　(1) Western-blotting和Real-Time PCR檢測(cè)EGFL7在胃癌細(xì)胞株（BGC823、SGC7901、MKN28和MKN45）

8、和胃黏膜正常細(xì)胞株GES-1中的表達(dá)，篩選出EGFL7低表達(dá)胃癌細(xì)胞株。
　　(2)構(gòu)建針對(duì)EGFL7過(guò)表達(dá)的突變質(zhì)粒載體，然后在這突變的載體基礎(chǔ)上進(jìn)行缺失結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒載體的構(gòu)建，分別缺失EMI(簡(jiǎn)稱:⊿EMI)、EGF(簡(jiǎn)稱:⊿EGF)、EGF-ca結(jié)構(gòu)域(簡(jiǎn)稱:⊿EGF-ca)，得到pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-EGFL7+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿ EMI+Flag、pGCM

9、V/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿ EGF+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿EGF-Ca+Flag質(zhì)粒載體;分別轉(zhuǎn)染至EGFL7低表達(dá)胃癌細(xì)胞株中，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
　　(3)通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)比較各細(xì)胞系的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。
　　(4)運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的情況。
　　(5)使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞失巢凋亡的情況

10、。
　　(6)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):觀察裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)情況;解剖裸鼠并切取移植瘤，觀察腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，制作HE切片觀察腫瘤的病理形態(tài)特征。
　　3、探究EGFL7誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制
　　(1)觀察EGFL7基因沉默及EGFL7過(guò)表達(dá)后胃癌細(xì)胞的形態(tài)變化。
　　(2)收集臨床胃癌及癌旁組織標(biāo)本79例，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)并分析EGFL7與EMT相關(guān)分子(E-Cadherin、Vime

11、ntin和Snail)之間的相關(guān)性。
　　(3)運(yùn)用Real-Time PCR檢測(cè)EGFL7基因沉默和EGFL7過(guò)表達(dá)及其缺失結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞系中的EMT相關(guān)分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)(MMP-9)和血管新生指標(biāo)(VEGF)的mRNA表達(dá)水平。
　　(4)使用Western-blotting檢測(cè)EGFL7基因沉默、EGFL7過(guò)表達(dá)及其缺失結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞系中的EMT相關(guān)分子(E-Cadh

12、erin、Vimentin和Snail)、侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)(MMP-9)和血管新生指標(biāo)(VEGF)的蛋白表達(dá)水平以及EGFR、ERK和AKT的總表達(dá)及磷酸化水平。
　　(5)先用EGF受體(EGFR)抑制劑AG1478處理EGFL7高表達(dá)細(xì)胞株(BGC823和MKN28-EGFL7)，再用Western-blotting檢測(cè)EMT相關(guān)分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵襲轉(zhuǎn)移指標(biāo)(MMP-9)和血管新生指標(biāo)(

13、VEGF)的蛋白表達(dá)水平以及EGFR、ERK和AKT的總表達(dá)及磷酸化水平;通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)比較抑制劑處理前后的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況的變化。
　　結(jié)果:
　　1、沉默EGFL7基因能夠降低胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力
　　(1)EGFL7在胃癌細(xì)胞BGC823中表達(dá)量最高;EGFL7基因沉默的穩(wěn)定胃癌細(xì)胞系建立成功。
　　(2)EGFL7基因沉默能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞失巢凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不能影響胃癌細(xì)胞的增殖

14、和生長(zhǎng)。
　　(3)與對(duì)照組比較，EGFL7基因沉默組的裸鼠體內(nèi)腫瘤肝轉(zhuǎn)移數(shù)目減少。
　　2、EGFL7過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，EGF結(jié)構(gòu)域是EGFL7的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域
　　(1)EGFL7在胃癌細(xì)胞MKN28中表達(dá)量最低;EGFL7過(guò)表達(dá)及缺失結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定胃癌細(xì)胞系建立成功。
　　(2)EGFL7過(guò)表達(dá)能夠提高胃癌細(xì)胞的失巢凋亡抵抗能力，抑制凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但不能影響胃癌細(xì)胞的增殖和

15、生長(zhǎng)。
　　(3)在缺失EGF結(jié)構(gòu)域后能升高胃癌的失巢凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，說(shuō)明EGF結(jié)構(gòu)域是EGFL7的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。
　　(4)與對(duì)照組比較，EGFL7過(guò)表達(dá)組的裸鼠體內(nèi)腫瘤肝轉(zhuǎn)移數(shù)目增加。
　　3、EGFL7通過(guò)AKT的磷酸化促進(jìn)胃癌細(xì)胞的EMT
　　(1)EGFL7表達(dá)高的細(xì)胞株細(xì)胞形態(tài)顯示為細(xì)胞間緊密連接減少和典型的梭形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，而EGFL7表達(dá)低的細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)呈小細(xì)胞大小和鵝卵石樣的形

16、狀，細(xì)胞間緊密排列呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)。
　　(2)采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)分析。EGFL7表達(dá)與Vimentin的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.620，P＜0.05)，與Snail的表達(dá)亦成正相關(guān)(r=0.492，P＜0.05)。但是，它的表達(dá)與E-Cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.304，P＜0.05)。
　　(3)EGFL7基因沉默能夠降低EGFR和AKT磷酸化水平。
　　(4)EGFL7基因沉

17、默能夠抑制Vimentin、Snail、MMP-9和VEGF的表達(dá)，而促進(jìn)E-Cadherin的表達(dá)。
　　(5)EGFR的抑制劑能夠降低EGFR和AKT的磷酸化水平。
　　(6)EGFR抑制劑能夠抑制Vimentin、Snail、MMP-9和VEGF的表達(dá)，而促進(jìn)E-Cadherin的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、沉默EGFL7基因的胃癌細(xì)胞的失巢凋亡抵抗能力減弱，侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，但不能影響胃癌細(xì)胞的增殖和生