半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）雌魚(yú)fosmid基因組文庫(kù)的構(gòu)建及初步分析.pdf

1、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國(guó)優(yōu)質(zhì)的大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但目前基因組研究較少，限制了許多研究工作的深入開(kāi)展。本研究構(gòu)建了第一個(gè)半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid基因組文庫(kù)，對(duì)文庫(kù)的部分克隆進(jìn)行了雙末端測(cè)序和序列分析，并從中篩選了部分微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)和一個(gè)性別相關(guān)序列。 主要結(jié)果如下： 1.半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid基因組文庫(kù)的構(gòu)建和鑒定本研究用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得半滑舌鰨雌性基因組大小約為606.

2、36 Mb；從半滑舌鰨雌魚(yú)肌肉提取基因組DNA，選取大小合適的DNA片段，經(jīng)末端修復(fù)并回收后，再以fosmid質(zhì)粒作為載體，構(gòu)建了半滑舌鰨雌魚(yú)基因組文庫(kù)。該文庫(kù)含有49，920個(gè)克隆，重組率為96.88％；插入片段長(zhǎng)度分布在33～45kb之間，平均為39.2kb，覆蓋率為雌性半滑舌鰨基因組的3.23倍，從文庫(kù)中篩選得到單拷貝DNA序列的概率為95.6％；對(duì)培養(yǎng)第一天和第六天的文庫(kù)克隆進(jìn)行比較檢測(cè)結(jié)果表明，文庫(kù)穩(wěn)定性高，培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生

3、變化。半滑舌鰨fosmid基因組文庫(kù)的構(gòu)建，為該物種基因組的研究工作奠定了基礎(chǔ)，為開(kāi)展測(cè)序、分子標(biāo)記發(fā)掘、功能基因篩選與定位、物理圖譜構(gòu)建等研究工作提供了有效的工具。 2.半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid末端序列分析本研究從半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid文庫(kù)中隨機(jī)選取1，152個(gè)克隆進(jìn)行雙末端測(cè)序，去除了大腸桿菌和載體的污染后獲得 2，247條序列。序列總長(zhǎng)1，921，341bp，大約占半滑舌鰨雌魚(yú)基因組的3.170‰，A+T含量為57.9％

4、，G+C含量為42.1％。對(duì)這些序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明在2，247條序列中，有848條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有的序列有明顯的相似性(E

5、有232條，其中的32條序列與三刺魚(yú)的EST相似，31條與青鳉Oryzias latipes EST相似。BLASTX比對(duì)有明顯相似性的序列有384條，占序列總數(shù)的17.09％，其有144條序列與青黑斑河豚Tetraodon nigroviridis相似，106條與斑馬魚(yú)Danio rerio相似。 3.從半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid文庫(kù)中篩選微衛(wèi)星標(biāo)記本研究使用軟件TANDEM REPEATS FINDER(version 4.0

6、0)對(duì)隨機(jī)挑取的384個(gè)fosmid克隆的雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行微衛(wèi)星掃描，共發(fā)現(xiàn)了168個(gè)微衛(wèi)星序列。所得微衛(wèi)星序列使用PRIMER PREMIER version 5.0軟件共設(shè)計(jì)得到了101對(duì)擴(kuò)增引物，引物優(yōu)化后進(jìn)行PCR反應(yīng)，并以12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。在所有成功擴(kuò)增的位點(diǎn)中，有64個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到了多態(tài)性，其中有50個(gè)符合哈迪一溫伯格平衡。不同的引物獲得的等位基因數(shù)為2～9個(gè)不等，平均每對(duì)引物獲得4.1個(gè)等位基因。期

7、望雜合度(HE)為0.05～0.94，觀測(cè)雜合度(H0)為0.06～1.00。 4.從半滑舌鰨雌魚(yú)fosmid文庫(kù)中篩選性別相關(guān)序列本研究從fosmid文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果中隨機(jī)挑取384個(gè)克隆的雙向測(cè)序結(jié)果，除去測(cè)序失敗的克隆后，使用PRIMER PREMIER version 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。設(shè)計(jì)結(jié)束后，從每個(gè)克隆的兩對(duì)引物中選取預(yù)期PCR擴(kuò)增結(jié)果較好的一對(duì)進(jìn)行合成，共得到了374對(duì)PCR擴(kuò)增引物。利用雌魚(yú)DNA池和

8、雄魚(yú)DNA池為模板對(duì)設(shè)計(jì)得到的引物進(jìn)行初步PCR擴(kuò)增篩選，退火溫度統(tǒng)一設(shè)定為50℃。對(duì)擴(kuò)增出差異的引物和沒(méi)有擴(kuò)增出明顯條帶的引物，利用溫度梯度PCR優(yōu)化每對(duì)引物的最佳退火溫度，并在最佳退火溫度下再次用雌魚(yú)DNA池和雄魚(yú)DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選和電泳檢測(cè)。對(duì)仍然擴(kuò)增出雌雄差異的引物，使用12個(gè)個(gè)體的DNA在其最佳退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以排除個(gè)體差異的可能。最終經(jīng)個(gè)體驗(yàn)證后獲得了1對(duì)雌雄差異引物。該引物所對(duì)應(yīng)的克隆號(hào)為B169-47，